1999 ж. Шыға издается бастады с 1999 г

50 
 
UDC 636.22/.28.082.12 
Bimenova J.J., Ussenbekov Y.S.   
 
Kazakh National Agrarian University 
 
OPTIMIZATION OF CONDITIONSPOLYMERASE CHAIN REACTION  
FOR DETECTION ALLELES GDF-9GENE OF COWS 
 
Abstract 
Growth differentiation factor 9 (GDF9) belongs to the transforming growth factor 
β 
superfamily and plays a critical role in ovarian follicular development and ovulation rate. This 
article discusses the possibility of using the polymerase chain reaction for  the study of gene 
polymorphism GDF 9 cows black-and-white breed. Conducted optimized to PCR conditions, ie 
the optimal annealing temperature of the primers and the concentration of magnesium chloride in 
the reaction mixture. 
Key words: PCR, RFLP, polymorphism, Growth differentiation factor 9, folliculogenesis. 
 
Introduction  
Growth  differentiation  factor  9  (GDF9)  belongs  to  the  transforming  growth  factor  β 
superfamily and plays a critical role in ovarian follicular development and ovulation rate [1,2]. 
Previous studies have shown that GDF9 is involved in cumulus expansion, hyaluronic acid 
synthesis signaling, maintenance of an optimal oocyte microenvironment, and synergistic action 
along with bone morphogenetic protein 15 through the regulation of  several key granulosa cell 
enzymes that are essential for normal ovulation, fertilization, and female reproduction [2,  3,4]. 
Given the central role of GDF9 in ovulation and reproduction, GDF9 is a good candidate gene 
for mutations associated with reproductive performance. This gene has been widely studied in 
humans, sheep, and goats [5].  However, studies of GDF9 and bovine reproduction are relatively 
rare. 
Studies have established the influence of genetic polymorphism of BMP and GDF 9 15 
sheep on the number ovulated follicles and ovulation rate. For example, gene alleles, Bone 
morphogenetic protein -  BMP 15 sheep, influence the process of folliculogenesis and for this 
locus heterozygous sheep ovulate two or three oocytec. The authors of this study recommend the 
use of BMP 15 gene polymorphism in sheep as a DNA marker for improving fertility in sheep 
breeding animals [6]. In 2013 there was the first report of gene polymorphism GDF 9 (Growth 
differentiation factor 9) in cattle and the relationship of alleles of this gene with suitable access 
for transplantation embryos donor cows, with the total number of embryos.  9 GDF gene in cattle 
has length 3824 nucleotide pairs, exon portion of the gene was conserved and hasn’t mutations, 
in the intron portion two point mutations were detected. It is known that the gene products GDF 
9 process control follicle growth and its development in cows. Polymorphism of this gene is well 
studied in medicine, in women with a mutation in the coding region of the gene GDF 9 found 
signs of premature ovarian failure [7,8]. 
Chinese scientists found that high yields of high-quality embryos for transplantation was in 
donor cows with the CT genotype A485,  also was positive correlation with the total number of 
embryos and genotype donor cows A625 AA. Thus, the authors suggest the use of 
polymorphism GDF 9 cows as a DNA marker for predicting the reproductive function in cows. 
In connection with the above, has been tasked to study gene polymorphism GDF 9 cows of 
black-and-white breed. in the conditions of breeding farm LLP "Bayserke-Agro" and put 
technology diagnostic PCR mutation locus GDF 9. 
Materials and methods Blood for the experiments was taken from cows of black-motley 
breed from the jugular vein of vacuum tube with EDTA. The blood samples were delivered to 

51 
 
the laboratory an were stored in a freezer at -20 ° C. Isolation of DNA from blood was performed 
according to the instruction set "DNA sorbitol " (made in Russia) . Carrying out PCR to 
determine the point mutation of the gene in intron 9 GDF comprises selecting primers. The first 
step is to identify sequence of forward and reverse primers for amplification of the desired DNA 
fragment. Firstly, from the site NCBI was taken out of database complete gene sequence of GDF 
9 (format Pasta), animal species - Bostaurus. In the next step, using the known sequences of the 
primers identified site-specific point mutations in intron 9 of GDF gene. Work on genotyping 
cows gene locus GDF 9 held in 2013 in educational research and diagnostic laboratory 
Kazakhstan-Japan Innovation Center Kazakh National Agrarian University. Instruments used: 
Centrifuge Eppendorf company, Vortex, thermostat, horizontal electrophoresis apparatus, 
Thermocyclers" Tertsik " and " Eppendorf " gel documenting system.  For amplification of the 
desired gene fragment GDF 9 A485T were used primers, that developed by the authors Tang 
K.Q et al(2013), which have the following sequences: forwardprimer  -F 5'-
AGGGAAGAAGAAAGATCTTTTGC 
-3 'and antisense primer 
R: 5'-
TCTACCCAGGCTTTAGTCCC  -  3'. Using this pair of primers amplify a region of the gene 
allows GDF 9 208 base pairs in length. In this case, the animals used for genotyping of the 
restriction enzyme NsiI, which has a restriction site ATGCA / T: 
For the detection of a point mutation in the second intron of the gene under study A625T, 
we used primers : direct F: 5'-ATGCCCTCATGGGTTGATGTAGGCTA -3 ' and reverse R: 5'-
CTCCCATCTCTCTCATACACACAAG  -  3' . Complementary sequence of the above primers 
were tested by us, by a computer program, the two pairs of primers were complementary to the 
gene under study GDF portion 9. Restriction of PCR product in the second experiment was 
conducted with a restriction enzyme DraI, which has a restriction site TTT/ AAA. 
 
 
 
 
Figure 1.Polymerase chain reaction product, Lanes 1, 2, 3, 4, 5 - amplificate, 376 bp, 6 - negative 
control, М – molecular size marker, pUC19 DNA/MspI. 
 
Success with the polymerase chain reaction depends on two factors: the concentration of 
MgCl
2
  in the reaction mixture and the primer annealing temperature. Optimum MgCl2 
concentration determined experimentally, primer annealing temperature was calculated by using 
the computer program «calculators for calculating the melting temperature of the primers».The 
optimum temperature for annealing the forward primer F 5'-
AGGGAAGAAGAAAGATCTTTTGC  -3 ' was 58,08 ° C, and reverse primer R: 5'-
TCTACCCAGGCTTTAGTCCC - 3' temperature of 56,80 ° C. 
Another important factor is that the concentration of MgCl
2
, in the reaction mixture. It is 
now established that by increasing the MgCl
2
  concentration increased synthesis of DNA 
molecules, but non-specific amplification is observed. Successful amplification passed at a 
concentration of 1.5 mM MgCl
2
  and primers, an optimum annealing temperature was 58.0 C. 
The reaction volume was 50 ul having a composition: 5 ul of 10 X PCR buffer, 1.5 mM MgCl
2
, 

52 
 
2,5 l of 25 mM direct and reverse primer, 5 l of 0.2 mM concentration of each dNTP, 0,5 l of an 
enzyme with the activity of Taq Polymerase 5u/μl, 5 microliters of DNA and 26.5 l of distilled 
water. 
Using polymerase chain reaction together with RFLP allows for 5-6 hours to conduct 
animal genotyping loci A485T and A625T gene differentiation growth factor 9 (GDF 9). 
 
References 
 
1.
 
Elvin JA, Clark AT, Wang P, Wolfman NM, et al. (1999). Paracrine actions of growth 
differentiation factor-9 in the mammalian ovary. Mol. Endocrinol. 13: 1035-1048.  
2.
 
McNatty KP, Juengel JL, Reader KL, Lun S, et al. (2005). Bone morphogenetic protein 
15 and growth differentiation factor 9 co-operate to regulate granulosa cell function in 
ruminants. Reproduction129: 481-487.  
3.
 
Eppig JJ, Chesnel F, Hirao Y, O’Brien MJ, et al. (1997). Oocyte control of granulosa 
cell development: how and why. Hum. Reprod. 12: 127-132. 
4.
 
Yan C, Wang P, DeMayo J, DeMayo FJ, et al. (2001). Synergistic roles of bone 
morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarian function. Mol. 
Endocrinol. 15: 854-866. 
5.
 
McNatty KP, Juengel JL, Wilson T, Galloway SM, et al. (2003). Oocyte-derived growth 
factors and ovulation rate in sheep. Reprod. Suppl. 61: 339-351. 
6.
 
Barzegari A, Atashpaz S, Ghabili K, Nemati Z, et al. (2010). Polymorphisms in GDF9 
and  BMP15  associated with fertility and ovulation rate in Moghani and Ghezel sheep in Iran. 
Reprod. Domest. Anim. 45: 666-669. 
7.
 
Tang K.Q., Yang W.C., Li S.J. and Yang L.G.  (2013)  Polymorphisms of the bovine 
growth differentiation factor 9 gene associated with superovulation performance in Chinese 
Holstein cows. Genetics and Molecular Research 12 (1): 390-399  
8.
 
Tang K.Q., Yang W.C., Li S.J. and Yang L.G.  (2013).  Polymorphisms of the bovine 
growth differentiation factor 9 gene associated with superovulation performance in Chinese 
Holstein cows. Genetics and Molecular Research 12 (1): 390-399  
 
Бименова Ж.Ж., Усенбеков Е.С. 
 
СИЫРЛАРДА GDF-9 ГЕНІНІҢ АЛЛЕЛЬДЕРІН АНЫҚТАУ ҮШІН ПОЛИМЕРАЗДЫҚ  
ТІЗБЕК РЕАКЦИЯСЫН ЖҮРГІЗУ ШАРТТАРЫН ОҢТАЙЛАНДЫРУ 
 
Мақалада  өсу  факторының  дифференциясы  9  трансформалық  β  супертуыстығына 
жататынын  және  осы  фактордың  аналық  жануарлардың  жұмыртқалықтарында 
фоллкулогенез үрдісіне және овуляция өту жылдамдығына байланысты екені зерттелген. 
Осы  мақсатта  авторлар  қара-ала  тұқымдас  сиырларда  GDF  9  генінің  полиморфизмін 
анықтауға  полимераздық  тізбек  реакциясын  пайдалану  мүмкіндігін  көрсеткен.  ПТР 
жүргізу  шарттары  оңтайландырылған,  праймерлер  жабысу  температурасы  мен 
реакциялық қоспадағы магния хлоридінің концентрациясы анықталған.  
Кілт  сөздер:  ПТР,  РФҰП,  полиморфизм,  өсу  факторының    дифференциясы  9,      
фолликулогенез. 
 
 
 
 
 
 

53 
 
Ж.Ж. Бименова, Е.С. Усенбеков  
 
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ  
ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АЛЛЕЛЕЙ  ГЕНА GDF-9 У КОРОВ   
 
Фактор  дифференциации  роста  9  (GDF9)  принадлежит  трансформирующему  
фактору роста β суперсемейства и играет важнейшую роль в регуляции роста  фолликулов 
и  скорости  овуляции.  В  статье  рассматривается  возможность  применения  полимеразной 
цепной реакции для изучения полиморфизма гена GDF 9 у коров черно-пестрой породы. 
Проведена оптимизиация условий ПЦР, т.е. установлена оптимальная температура отжига 
праймеров и концентрация магния хлорида в реакционной смеси. 
Ключевые  слова:  ПЦР,  ПДРФ,  полиморфизм,  фактор  дифференциации  роста  9,  
фолликулогенез. 
 
 
УДК 619:616.981.459.636.22/28 
 
К.Б. Бияшев
2
, Г.Д. Чужебаева¹, Ж.С. Киркимбаева
2
, С.Е. Ермагамбетова²,  
Р.М. Рыщанова¹, А. Ульянов¹ 
 
Костанайский государственный университет имени А. Байтурсынова¹ 
Казахский национальный аграрный университет² 
 
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК PASTEURELLA MULTOCIDA ИЗ ОБРАЗЦОВ 
БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПЦР:  
СРАВНЕНИЕ И ОЦЕНКА 
 
Аннотация 
В  статье  на  основании  литературных  источников  и  собственных  исследований 
приведены  результаты  исследований  по  выбору  оптимального  метода  выделения  ДНК 
Pasteurellamultocida 
из биологического материала. 
В результате выбора оптимальных методов выделения ДНК Pasteurellamultocida  из 
биологического материала, определили, что все использованные в работе методы 
выделения ДНК вполне приемлемы для экстракции геномной ДНК Pasteurellamultocida, но 
наибольшее количество ДНК выделено с помощью ФХЭ с гуанидином. Отношение 
оптической плотности (Е
260
/Е
280
) полученных препаратов ДНК Pasteurellamultocida  имело 
средние значение 1,7 
>
 0,04. 
Несмотря на многоступенчатость и продолжительность 
анализа в сравнении с новыми высокочувствительными и простыми в исполнении 
методами выделения ДНК, этот метод является оптимальным для выделения 
аналитических количеств ДНК в случаях, когда нет большого потока исследований.
 
 
Ключевые  слова:  Pasteurellamultocida,  выделение,  ДНК,  спректрофотометрия, 
электрофорез. 
 
Введение 
К настоящему времени в арсенале исследователей имеется довольно большой набор 
методов экстракции и очистки  ДНК, причем эти методы продолжают совершенствоваться 
и  модифицироваться  применительно  к  новым  объектам  исследования.  В  связи  с 
разнообразием  живых объектов  универсальных  методов  выделения  ДНК  не  существует. 
Использование того или иного метода выделения ДНК диктуется, во-первых, спецификой 

54 
 
изучаемого материала, а во-вторых, тем, какая преследуется цель: получение суммарной, 
ядерной, хлоропластной ДНК или других ее препаратов[1]. Метод выделения ДНК должен 
быть  относительно  простым,  хорошо  воспроизводимым  и  давать  возможность  быстрого 
получения  достаточных  количеств  удовлетворительно  очищенных  препаратов  ДНК. 
Выход  ДНК  зависит  от  природы  исходного  материала  и  обусловлен  содержанием  ДНК  в 
данной ткани, а также наличием и характером примесей, препятствующих очистке ДНК. В 
любом случае ДНК должна содержать минимальное количество примесей полисахаридов и 
белков  (не  более  2—3%),что  отражается  на  такназываемых  спектральных характеристиках 
препаратов  А
260
/А
280 
приблизительно равное 1,8.[2]. 
Целью  и  задачей  наших  исследований,  являлось  подбор  оптимальных  вариантов 
выделения ДНК Pasteurellamultocida из биологического материала. 
Материалы и методы 
 
Исследования  проводились  в  лаборатории  «Молекулярной  биологии  и  генной 
инженерии  вирусов»  НИИПББ  НЦБ  РК,    лаборатории  противо  бактериозной 
биотехнологии  Казахского  национального  аграрного  университета,  филиале  
Костанайская НИВС. 
1.  Метод  фенол-хлороформной  экстракции  (ФХЭ)  с  предварительной  обработкой 
протеиназой  К.  Клеточный  осадок  ресуспендировали  в  300  мкл  раствора  №  1  (100 
мМтрис-HCl рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 2 мг/мл лизоцима) и инкубировали 60 мин при 37°С. 
Добавляли 50 мкл раствора № 2 (8% додецилсульфат натрия (SDS) и 50 мкл протеиназы К 
(2 мг/мл). Хорошо перемешивали и инкубировали при 42°С 60 мин. Затем добавляли 200 
мкл  фенола  и  200  мкл  хлороформа,  интенсивно  перемешивали  и  центрифугировали  10 
мин  при  12  000  об/мин.  Верхнюю  фазу  переносили  в  чистую  пробирку,  не  затрагивая 
нижнюю  фазу  и  интерфазу.  Проводили  повторную  экстракцию  400  мкл  хлороформа.  К 
водной  фазе  добавляли    40  мкл  ЗМ  ацетата  натрия  (рН  5,4)  и  800  мкл  96%  этилового 
спирта,  тщательно  перемешивали.  Инкубировали  в  течение  ночи  при  —  20°С.  ДНК 
осаждали  центрифугированием  15  мин  при  12  000  об/мин.  Осадок  промывали  400  мкл 
75% этилового спирта, сушили при 37°С в течение 15 мин и растворяли в 30 мкл воды[3].  
2.  Метод  фенол-хлороформной  экстракции  с  гуанидином.  К  клеточному  осадку 
добавляли  250  мкл  лизирующего  буфера  (6  М  GuHCl,  40  мМтрис-HCl  рН  6,4,  36  мМ 
ЭДТА) и тщательно перемешивали. Смесь прогревали 5 мин при 65°С и добавляли  
125  мкл  фенола  и  125 мкл  хлороформа.  Далее  выделяли  так  же,  как  и при  ФХЭ  с 
протеиназой К.  
3. Метод сорбции ДНК на силикагеле. В пробирки емкостью 1,5 мл с клиническими 
образцами  вносили  по 250  мкл  лизирующего  раствора  (6  М  GuHCl,  40  мМтрис-HCl  рН 
6,4, 36 
мМ ЭДТА) и тщательно перемешивали на вортексе. Прогревали пробирку 5 мин 
при  65°С,  тщательно  перемешивали  на  вортексе  до  полного  растворения  материала. 
Добавляли  20  мкл  ресуспендированного  на  вортексе  сорбента  (Silica  S-5631, "Sigma"), 
хорошо перемешивали и отстаивали 7—9 мин. Сорбент осаждали на микроцентрифуге в 
течение 30 сек. Отбирали супернатант и добавляли по 400 мкл отмывочного раствора (4 М 
GuHCl, 40 мМтрис-HCl рН 6,4), перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования 
сорбента,  осаждали  на  микроцентрифуге  в  течение  30  сек.  и  отбирали  супернатант. 
Повторяли  процедуру  отмывки  еще  раз.  Осадок  промывали  70%  этиловым  спиртом  и 
высушивали в термостате при 56°С в течение 10 мин. Добавляли 100 мкл элюирующего 
буфера  (80  мМNaOH,  0,5  мМ  ЭДТА),  тщательно  ресуспендировали  и  помещали  в 
термостат при 56°С на 10 мин, затем добавляли 5,3 мкл раствора 1 М трис-HCl рН 6,4 и 
встряхивали на вортексе. Суспензию осаждали на микроцентрифуге при 10 000 об/мин в 
течение 1 мин. Супернатант содержал очищенную ДНК[4,5]. 
Выделение  ДНК  другим  методом  проводили  с  применением  лизирующего  буфера, 
содержащего гуанидина гидрохлорид. Авторы опубликованных в литературе протоколов 

55 
 
используют 
разные 
хаотропные 
агенты, 
предпочтительно 
применяются 
гуанидинатиоционат  (GuaSCN)  или  гуанидина  гидрохлорид  (GuaHCl),  рекомендуемый 
диапазон  рабочих  концентраций  которых  от  1M  до  4M  для  GuaSCN  и  6-8M  для 
GuaHCl[6].  
 
Результаты исследований 
При выборе оптимальных методов выделения ДНК Pasteurellamultocida,  учитывали 
некоторые  особенности  строения  бактериальной  клетки.  Стенки  грамотрицательных 
бактерий,  к  которым  относится  Pasteurellamultocida,  более  сложные  по  химическому 
составу, чем у грамположительных,  в них содержится значительное количество липидов, 
связанных  с  белками  и  сахарами  в  сложные  комплексы  —  липопротеиды  и 
липополисахариды.  
В  нашем  исследовании  мы  сравнили    несколько  способов  выделения  ДНК 
Pasteurellamultocida.  
В первых двух методах для удаления белков применяли комбинацию растворителей 
фенол  –  хлороформ,  которая  является  сильным  средством  депротеинизации.  При 
перемешивании  клеточного  лизата  и  фенола  формируются  две  фазы.  ДНК  находится  в 
верхней (водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе [6]. 
Водный экстракт переносится в чистую пробирку, и нуклеиновая кислота была осаждена 
3М  ацетатом  натрия,  с  последующим  промыванием  осадка  в  спирте  (100,  70% 
этанол).Методы  с  использованием  фенол-хромосомной  экстракции  достаточно  просты, 
недороги,  обеспечивают  стабильность  препарата  ДНК  в  процессе  хранения,  но  их 
недостатком  является  тот  факт,  что  фенол  и  хлороформ  –  токсичные  соединения  и 
требуют утилизации после использования[7]. 
В качестве лизирующих агентов использовали додецилсульфат натрия (SDS), ЭДТА 
и  лизоцим.  Анионные  детергенты,  к  которым  относитсяSDS  в  буферных  растворах 
дезорганизуют  двухслойные  липидные  образования  мембран,  разрушают  нековалентные 
связи  и  стабилизируют  белки,  тем  самым  разрушаются  липидно-белковые  комплексы 
мембран,    при  этом  ДНК  экстрагируется  в  буфер  [8].  Конечный  размер  получающихся 
фрагментов  ДНК  зависит  от  двух  основных  факторов:  действия  клеточных  нуклеаз  и 
механического  разрушения  ДНК  в  процессе  выделения.  Применение  додецилсульфата 
натрия  не  только  депротеинизирует  бактериальную  клетку,  но  также  подавляет 
активность  нуклеаз.  ЭДТА  и  лизоцим  разрыхляют  наружную  мембрану,  ингибируют 
нуклеазы  – разрушают клеточную стенку. 
Клеточные белки удаляли обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой 
К,  который  эффективно  инактивирует  нуклеазы,  будучи  устойчивым  при  этом  к 
денатурирующим (SDS, мочевина), хелатирующим (ЭДТА) и сульфгидрильным агентам. 
Активация этого фермента более чем в 7 раз в присутствии мочевины и SDS обусловлена 
главным  образом  денатурацией  белков-субстратов  в  этих  условиях.  Данная  протеаза 
работает  в  широком  диапазоне  рН  (4-12).  Денатурирующие  агенты  повышают 
доступность пептидных связей белков для протеиназыК[9]. 
При выделении ДНК методом сорбции на силикагеле также использовали гуанидин 
гидрохлорид.  Силиконовый  матрикс  связывает  ДНК  в  присутствии  высоких 
концентрацийхаотропных  солей,  таких  как  гуанидингидрохлорид,  которые  разрушают 
гидрофобные  взаимодействия.  По  определению  исследователей,  метод  имеет  два 
преимущества: дешевизнасиликон диоксида и  универсальность протокола для широкого 
приложения для очистки ДНК [10].1 мл/г силикон диоксида способен связатьдо 3-4,5 мкг 
ДНК и в таком состоянии стабильность ДНК сохраняется до 12 месяцев. Очевидно, что 
количество  используемого  силикагеля  зависит  от  предполагаемого  количестваДНК  в 
исходном материале; ДНК отделяется от силикагеля при понижении концентрациисоли, а 

56 
 
также быстрым центрифугированием (10 сек.); либо ДНК может быть отмыта небольшим 
объемом  (от  5  мкл)  воды,  облегчить  элюцию  можно  нагреванием.  Предлагаемыйметод 
прост, быстр и экономичен, не требует специальных колонок и оборудования, чтоделает 
его  привлекательным  при  большом  объеме  образцов  в  экспериментах. 
Силикагельвключается во многие коммерческие наборы  экстракции ДНК.  
Начальные  условия  были  одинаковыми  для  всех  методов,  так  как  выделение 
проводилось из одного образца, разделенного на 6 равных частей. Для того чтобы свести к 
минимуму ошибку при наборе материала, исследование повторяли 3 раза и за количество 
ДНК принимали среднее значение. 
После  выделения  ДНК  Pasteurellamultocida  вышеперечисленными  методами 
проводили  качественный  и  количественный  анализ  образца.  Электрофорез  проводили  в 
0,
8 % агарозном геле в ТАЕ-буфере. Наибольшее количество ДНК выделяется с помощью 
ФХЭ  с  гуанидином  и  ФХЭ  с  предварительной  обработкой  протеиназой  К.  Отношение 
оптической плотности (Е
260
/Е
280
) полученных препаратов ДНК Pasteurellamultocida  имело 
среднее  значение  1,65
0,04 (
n
=3).Результат  качественного  анализа  полученного 
препарата ДНК  представлен на электрофореграмме (рисунок 1).  
 
 
 
Рисунок 1 – Электрофореграмма выделенных ДНК Pasteurellamultocida  различными 
методами: 1-3 - ФХЭ с гуанидином; 4-6 - ФХЭ с предварительной обработкой 
протеиназой К; 5-6 - сорбция ДНК на силикагеле 
 
По  чувствительности  ФХЭ  превосходит  методы  сорбции  на  силикагеле.  Методы, 
основанные  на  ФХЭ,  дают  хороший  выход  ДНК,  но  очень  трудоемки.  Еще  одним 
отрицательным фактором в них является токсичность фенола и хлороформа, что требует 
наличия вытяжного шкафа в лаборатории, где эти методы применяются.  
В таблице 1 представлены результаты типичного эксперимента по выделению ДНК  
стабилизированной  трилоном  Б  цельной  крови  молоднякакрупного  рогатого 
скотаметодом ФХЭ с гуанидином (таблица 1).  
 
Таблица 1 -  Результаты выделения ДНК цельной крови крупного рогатого скота 
Номер 
пробы 
Концентрация ДНК (нг/мкл) 
Выход ДНК из 100 мкл 
крови  (мкг) 
А 260/280 
1 
49,4 
1,7 
1,7 
2 
38,6 
1,3 
1,6 
3 
50,0 
1,7 
1,6 
4 
37,3 
1,3 
1,6 
5 
47,1 
1,6 
1,7 
6 
51,5 
1,7 
1,7 
 

57 
 
В  данном  эксперименте  ДНК  выделяли  из  6-ти  проб  крови  от  разных  животных. 
Выход  ДНК  варьировал  в  диапазоне  1,3  -  1,7  мкг  из  100  мкл  крови.  Для  определения 
чистоты  выделенной  ДНК  её  осаждали  этанолом,  растворяли  в  воде  и  определяли 
отношение  оптических  плотностей  на  260  нм  и280  нм  с  использованием 
спектрофотометра  Pro RNA/DNA Calculator «GenQuant». Отношение А260/А280 близкое 
к 1,8 указывает на то, что ДНК обладает высокой чистотой. 

жүктеу/скачать 5,87 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: