Тақырыбы: Тозаңқаптарды іn vіtro өсіріп гаплоидтарды алу Дәріс тезистері: 1 Гаплоидтар жәнс олардың селекциядағы маңызы
2 Тозаңқапты және тозаңдарды қоректік ортада өсіріп гаплоидтар алу
3 Будан ұрыкта хромосомалардыц селективті жойылуы әдісімен гаплоидтарды алу
Сомалық жасушалар ядроларында сыңар хромосомалар жиынтығы / п /, яғни түрдің өзіне тән хромосомаларының толық жиынтығының / 2п / жартысы бар организм гаплоид деп аталады.
ГАПЛОИД - сыңар, дара /гаплоидты/ хромосомалар жиынтығы болатын ядро, жасуша, организм; гаметаларда сыңар хромосомалар жиынтығы болады.Гаплоидтар гаметаның генотипін сақтайтын организмдер. Олар репродуктивтік жасушалардан апогамия / ұрықтың синергидадан немесе антиподадан түзілуі /, немесе андрогенез / ұрықтың аталық гаметадан тузілуі / құбылысы нәтижесінде пайда болады.
Селекцияның дағдылы әдістері арқылы гаплоидтарды тәжірибеде алу жолдары /тұраралық және туысаралық тозаңдандыру, рентген сөулесімен өсер ету т.б./ тиімсіз және уақытты көп талап етеді. Жаңа әдістерді қолданып, мысалы, аталық гаметофитті / тозаңды / және аналық гаметофитті / ұрық қалтасы / іп vitro өсіру гаплоидтарды алуды бірнеше рет тездетеді және селекция процессін жеңілдетеді (10 сурет).
2. Бірінші С.Гуха және С.Махешвари 1964 жылы Индияда меңдуана тозаңқаптарын қоректік ортада өсіріп, гаплоидтық өсімдіктерді алғашқы рет алған. Одан кейін, бұл тәжірибелерді темекі өсімдігімен Францияда К.Нич 1967 жылы қайталап жасады. Сол уақыттан бері осы әдіспен 200-ден астам түрден гаплоидтық өсімдіктер алынды, соның ішінде: арпа, сұлы, күріш, картоп, рапс т.б. бар. Тозаңқаптарды жасанды ортада өсіру арқылы алынған гаплоидтар аталық гаметаның генотипін ұстайды, бұл процесс андрогенез деп аталады, бұл терминді кейбір ғалымдар келіспейді деп есептейді. Андрогенез тікелей және жанама жолмен өтуі мүмкін. /11 сурет/. Тікелей андрогенез тозаңдық эмбриогенездің аркасында, яғни микроспоралардың бөліну жолымен түзілетін эмбриоидтардан гаплоидтық өсімдіктердің пайда болуы. Гаплоидтық өсімдіктердің микроспоралардың дедифференциялануы нәтижесінде түзілетін каллустардан пайда болуы жанама андрогенез деп аталады.
Каллустан қоректік ортада алынған өсімдіктердің бәрі бірдей гаплоидтық бола бермейді. Сондықтан гаплоидтарды сансыз мөлшерде алу үшін, тозаңдық эмбриогенезді индукциялауға тырысады.
Тұтас тозаңқаптарды қоректік ортада өсіргенде каллус жасушаларының диплоидтық спорогенді тозаңқап жасушаларынан пайда болуы мүмкін екендігін атап өту керек. Осындай каллустардан өскен өсімдіктер диплоидтық немесе полиплоидтық болады. Сонымен қоректік ортада өскен тозаңдар жасушаларында мынадай процесстер журуі мүмкін:
1/ эмбриоидогенез;
2/ дедифференциялану және каллусогенез;
3/ шар тәрізді формалары бар құрылымдар пайда болады;
4/ микроспорогенез және гаметогенез жалғасады;
5/ микроспоралар кері кетеді.
Регенерант өсімдіктер, соның ішінде гаплоидтық өсімдіктер алғашқы екі процесстің арқасында алынған.
іп vitro жағдайында аталық гаметофиттен гаилоидтық спорофиттің пайда болуы өте күрделі және аз зерттелген процесс. Микроспоралардың даму жолдары өте күрделі, бастапқыда проэмбрио, одан кейін эмбриоид пайда болады. Бұл процесстің қалай басталатыны және реттелетіні белгісіз. Н.Сандерленд қызметкерлерімен бірге мендуананың оқшауланған микроспораларын қоректік ортада өсіріп, оның дамуының бастапқы кезеңдерін зерттеп, микроспоралардың қалыпты жағдайда дамуы өзгеше болатынын анықтады.
Микроспоралардың қалыпты in vivo дамуы келесі кезеңдерден тұрады:
1/ екі мейоздың қорытындысында тозаңның аналық жасушасынан микроспоралардың тетрадасы пайда болады
2/ қалыңдаған тетрада кабығынан микросиоралардың босануы;
3/ микроспора дамиды, екі митоз нәтижесінде жетілген тозаң пайда болады.
Iп vitro жағдайда тозаңның қалыпты дамудан ауытқуы микроспораның дамуының кез-келген кезеңінде жүруі мүмкін.
Тозаңқапты қоректік ортада өсіргенде екі вегетативтік ядросы бар микроспора /дамудың В жолы / пайда болуы мүмкін, немесе вегетативтік ядро генеративтік ядромен кұйылып қосылады, диплоидтық жасуша түзіледі /дамудың С жолы/. Осындай микроспоралар бөлінгенде пайда болатын проэмбрионың өз ерекшіліктері болады. Әр түрлі эмбриондар іп vitro жағдайында вегетативтік және генеративтік жасушалары бар қалыпты микроспораның пайда болуы мүмкін /дамудың А типі/, өйткені, олардың түзілуіне вегетативтік немесе генеративтік жасуша не болмаса екі жасуша да катыса алады. Екі жасуша қатысқан жағдайда диплоидтық эмбрионд жетіледі . Бұдан басқа даму кезеңінде аномалиялары болған / мейоздың бұзылуы / редукцияланбаған микроспорадан, сонымен қатар эмбриогенездің әр түрлі кезеңдерінде жүрген эндополиплоидия негізінде диплоидтар түзілуі мүмкін. Сөйтіп, проэмбрио түзілуінің әр түрлі цитологиялық жолдары бар және микроспораның даму бағыты көптеген факторлардың қатысуымен анықталады, соның ішінде олардың табиғи полиморфизмімен. Полиморфизм себептері мынада: даму кезіндегі аномалиялар, споралардағы бөліну шүйкесінің орналасуы т. б. Тозаңқапта болатын мыңдаған микроспораның тек бірен-саранынан ғана эмбриоид жетіледі. Эмбриоидогенезге қабілеттілік генетикалық негізделген болуы мүмкін. Стресстік ықпал мысалы, төмен және жоғары температура, иондалған сәулелермен әсер еткенде эмбриогендік микроспорапар санының артатыны тәжірибе жүзінде аныкталған. Тікелей андрогенезге өту үшін, донорлык өсімдіктің физиологиялық жағдайы, тозаңкапты жасанды ортаға отырғызу уақытындағы тозаңның даму кезеңі, қоректік орта кұрамы және жасанды ортада өсіру жағдайларының маңызы өте жоғары. Көптеген өсімдіктер үшін эмбриоид пайда болуда ең қолайлысы микроспораның бір ядролық кезеңі.
Фитогормондардың әсері микроспораның өсу кезеңіне байланысты болады. Мысалы, мейоз кезеңінде. фитогормондардың жоғары концентрациялары каллусогенезді күшейтеді, тетрада кезеңінде микроспораның калыптасуын және бірнеше митоздың өтуін, бір ядролық микроспора кезеңінде эмбриоидогенезді арттырады. Бұл жерде қоректік орта кұрамы туралы қалыптасқан пікір жок. Өсімдіктердің кейбір түрлері; мысалы, астық тұқымдастар сахарозаның жоғары концентрациясын талап етсе /12%-ке дейін/, басқа түрлері күрделі органикалық қосындыларды /казеин гидролизаты/, ашытқы экстракты солод және картоп экстрактылары, кокос сүті/, үшіншілері- темір иондарының белгілі бір ара қатынасын. Эмбриоидтар түзілуін индукциялау үшін қазіргі уакытта алдын-ала гүл кауызын төмен /3-5°С/ және жоғары /ЗО-35°С/ температураларымен өңдеуді кеңінен қолданады. Одан кейін крестгүлділер тозаңқаптарын қоректік ортада 3О°С температурада өсіргенде гаплоидтардың шығуы артқан. Эмбриоидтардан тұтас өсімдік өсіру үшін қоректік орта құрамы да өзгеше болады.
КазМҰУ-ның өсімдіктер физиологиясы және биохимия кафедрасында бидай мен арпа тозаңкаптарын өсіру жұмыстары табысты жүргізілген. Кейбір генотиптер үшін, тозаңқаптарды жасанды ортада өсіргенде, тура және жанама андрогенез алу жолдарын белгілейтін қоректік орта және өсіру жағдайлары іріктеліп алынған, олардың цитоэмбриологаясы зерттелген. Гаплоидтық регенерант өсімдіктер алынды.
Тұтас тозаңқаптарды жасанды ортада өсіргенде сомалық ұлпалардан плоидтылығы әр түрлі өсімдіктер пайда болуы мүмкін, сондықтан оқшауланған гүл тозаңын өсірудің болашағы зор. Бұдан баска, тозаңды ортада өсіргенде тозаңқап ұлпаларында бар, өсуді тежейтін заттардың әсері төмендейді. Тозаңдарды, тозаңқапты кесіп шығарып алады, не болмаса оларды сұйық қоректік ортада өсіреді, бұндай көзде тозаң түйіршіктері өзінен өзі тозаңкаптан ортаға төгіледі. Тозаңқаптары үлкен, тозаң түйірлері ірі және еркін орналасқан өсімдіктер тозаңы механикалық жолмен бөлінеді, мысалы, сасық меңдуана тозаңқаптарын қоректік ортада өсіргенде өнімді мол беретін түр. Көптеген өсімдіктерге, соның ішінде астық тұқымдастарға, бұл әдіс жарамайды, олар үшін қалқыған тозаңқаптар әдісі тиімді. Сонымен қатар бұл кезде тозаңқаптардан жуылып шығатын биологиялық активті заттар есебінен ортаның кұрамы байытылады. Микроспораларды сұйық қоректік ортада өсіргенде тек эмбриоидтар пайда болады, олардан жасыл өсімдіктер өсіп жетіледі. Тозаңдарды қоректік ортада өсіріп алынған регенерант өсімдіктердің ішінде альбиностардың көп болатынын атап өту керек. Олар тозаңның дамуы кезінде болатын бұзылу негізінде пайда болады. Сонымен іп vitro андрогенді гаплоидтар алудың көптеген қиындықтары бар, өйткені бұл мәселенің теориялық зерттелуі жетерліктей деңгейде емес. Біз микроспораның әр түрлі даму кезеңінде морфофизиологиялык процесстердің ішкі және сыртқы факторлармен реттелуінің қалай жүретінін, микроспоралардың тотипотенттілігін іске асыру үшін қандай жағдайлар қажет екендігін тағы сол сияқты сұрақтарға жауабын білмейміз.
Сонымен бірге, қытай зерттеушілерінің бірқатар ауыл шаруашылық дақылдарынан көп мөлшерде гаплоидтық өсімдіктер алуда қол жеткізген табыстарын атау керек. Генотипті, тозаңның даму кезеңін, коректік орта құрамын үйлестіруді, өсіру жағдайларын, микротамшыдағы тозаң тығыздылығын іріктеп алу т.б. ескеріп, олар андрогендік гаплоидтар негізінде күріштің құнды бірнеше сортын, бидайдың, жүгерінің, кара бидайдың, арпаның, темекінің, мақтаның, сояның, тұқымдық капустаның, каучук беретін өсімдіктердің, бұрыш т.б. дақылдар сорттарын шығарды.
3. Арпаның диплоидтық мәдени Hordeum vulgare түрін көп жылдық жабайы пиязшық Hordeum bulbosum түрімен будандастырғанда Hordeum vulgare хромосомалары жиынтығы бар моногаплоидтар шығады. Ұрықтың және эндоспермнің өсуінің бастапқы кезеңінде жабайы түр хромосомалары ұрықтанғаннан кейін 5 күн өткен соң селективті /іріктелген/ жойыла бастайды, яғни элиминациясы басталады. Сөйтіп, Hordeum vulgare хромосомалары толығымен жойылып кетеді, бірақ 15 күннен кейін будан ұрықтың дамуы тоқтап қалады. Оны іп vitro жағдайында өсіріп, будан өсімдікті шығаруға болады.
Тозаңдануға алынған өсімдіктерден будандастырудың екі жағдайында, Hordeum bulbosum аналық және аталық форма ретінде алынғанда да гаплоидтар шығады. Бірінші жағдайда мәдени түрдің жұмыртқа жасушасынан түзілген, яғни аналық белгілері бар гаплоидтар алынады, ал екінші жағдайда мәдени арпаның андрогендік, яғни аталық белгілері бар гаплоидтар пайда болады. Осы әдісті қолданып және будан ұрықтарды іп vitro өсіріп, Одессадағы селекция және генетика институтында дағдылы селекция жұмыстарын жүргізіп жаңа сорт алуға кететін 10-12 жылдың орнына, 4 жылдың ішінде жаздық арпаның жаңа сорттары Исток пен Одесская-115 шығарылған. Канада да осы әдіспен арпаның Минго және Родео сорттары шығарылған. Тозандандырғыш ретінде пайдаланылғанда жабайы арпа бидайда да мысалы, Чайниз Спринг сортында гаплоидтарды алуға жол ашады. Хромосомалардың селективті элиминациясы мен кейін ұрықтарды жасанды ортада өсіруді бірге жүргізгенде, диплоидтық арпадан /2п=14/ тек қана моногаплоидтарды /п=7/ алып қоймай, тетраплоидтық арпадан /2п=28/ дигаплоидтарды /2п=14/ алуға болады. Гаплоидтар ұрықсыз болғандыктан, фертильді өсімдіктер алу үшін, гаплоидтарды міндетті түрде диплойдтық күйге айналдыру керек. Гаплоидтық организмнен алынған дигаплоид өте ерекше гомозигота, таза линия болады.
Пиязшық арпаны будандастыруға пайдаланып және хромосомалар санын екі еселеп, гомозиготалар алуға керек уақытты бірден қыскартады, бұл өте маңызды, өйткені организм гаплоидтық форма күйінде тіршілік ету кезінде рецессивтік гендерден тазарады. Гаплоидтар мутациялық селекция үшін де өте құнды, себебі гаплоидтық деңгейде генетикалық өзгерулерді анықтау жеңіл болады. Хромосомаларды екі еселеу үшін күздік лапыздың алкалоиды-колцихин қолданылады, бірақ ол химиялық мутаген, сондықтан диплоидтану табиғи түрде жүретін болса тіпті жақсы болар еді. Жасушаларды іп vitro өсіру оған қол жеткізудің бірден-бір жолы.
