Бақылау сұрақтары: Жасушалық селекция әдістері
Мутанттарды алу жолдары.
Кері немесе вегативтік селекцияның әдістері.
15
Тақырыбы: ТІРШІЛІККЕ ҚАБІЛЕТТІ ПРОТОПЛАСТАРДЫ АЛУ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ІN VІTRO ЖАҒДАЙЫНДА ӨСІРУ.
Дәріс тезистері: 1. Протопластарды қосу арқылы будандастыру
2. Протопластарды бөліп алу.
3. Протопластардын тіршілікке икемділігі, оған әсер ететін факторлар
4. Протопластарды іп vitro-да өсіру
5. Протопластардан регенерант өсімдіктер шығару
6. Протопластардың бір-бірімен құйылысып қосылуы
1. Жасушалық инженерия - жасушаларды өсіру, оларды будандастыру және қайта құрастыру арқылы жасушаның мүлдем жаңа типін жасау әдістерінің негізінде қалыптаскан биотехнологияның саласы. Жасушаларды жасанды жолдармен будандастырғанда, сомалық (жыныстық емес) жасушаларды бір-біріне қосқанда будан геном түзіледі. Будандастырудың бұл тәсілінде аталық және аналық жасушалар ретінде жыныстық жасушалар (гаметалар) емес өсімдіктің дене (сомалық) жасушалары қосылады. Алдын ала протопластарын бөліп алады, белгілі жағдайда олар бір-бірімен құйылысады. Пайда болған сомалық будан жасушадан кейін регенерация арқылы будан өсімдіктер өсіп шығады.
Протопластарды қосу арқылы будандастыруды әр түрлі атайды: сомалық будандастыру, парасексуальды будандастыру, жыныстық емес будандастыру. Көбінесе бірінші термин колданылады, ал пайда болған будан сомалык будан деп аталады.
Жасушаны қайта құрастыру (реконструкция) - жасушаның құрамына кіретін ядроны, цитоплазманы, митохондрияларды, хлоропластарды, хромосомаларды бір жасушадан басқа жасушаға көшіру негізінде мүлдем жаңа жасушаны жасау. Осындай әрекеттер нәтижесінде ядролық және цитоплазмалық гендер тіркестігі әдеттегідей емес, тіпті өзгеше жасушалар пайда болуы мүмкін. Одан да артық ғалымдарды қызықтыратыны, ол жеке хромосомаларды тасымалдау арқылы анеуплоидтық линияларды алу мүмкіншшгі. Протопласт бөтен ДНК-ны қабылдай алатын өте ынғайлы жүйе. Сол ДНК жасушаға енгізіп және оның экспрессиясын қамтамасыз ету арқылы генетикалық өзгертілген өсімдіктерді алуға болады. Сөйтіп, протопластарды бөліп алу, өсіру, қосу және оларға жасушалық органоидтарды, жеке хромосомаларды, тіпті ДНК енгізу генетиктер мен селекционерлерге будан өсімдіктердің алуан түрлілігін арттыруға мүмкіншілік туғызады.
Сурет. Окшауланеан протопластарға негізделген жасушалык инженерия әдісі. 2. Протопласт деген ферментердің әсерімен немесе механикалық әдістермен қабығы түгел жойылған өсімдік жасушасы. Ағылшын ғалымы Э. Кокинг 1960-шы жылдардың басында жасушаның ішіндегі протопласты зақымдамай тірі күйінде бөліп алу әдісін жете зерттеп дайындады. Ол томат тамырларының ұштарын, зең саңырауқұлақтар өсірген ортасына бөліп шығарған гидролиздік ферменттерімен өңдеп, протопластарды ферменттік әдісімен бөліп алды.
Әдетте тірі жасушада протопласт жасушаның қабырғасына орталық вакуольдің тургор, яғни кернеулік қысымымен тығыз жанасып тұрады. Жасуша қабығы арқылы плазмалеммамен қоршалған цитоплазмалық жінішке жіпшелер өтеді, солар арқылы көршілес жасушалардың протопластары біріне-бірі жалғасып жатады. Сондықтан жасуша қабығын ферментпен еріткен кезде, протопластарға зиян келтірмей жасушаларда плазмолизді жүргізеді. Осмотик ретінде сахароза, маннит, сорбит қолданылады. Осы заттардың гипертониялық ерітінділері әсерінен вакуоль сусызданып жиырылып, протопласт көлемі кішірейіп, соңынан қабықтан алшақтайды. Кейде жасуша сопақ болғанда протопласт плазмолиз кезінде екі бөлініп кетуі мүмкін. Сондай ядросы жоқ субпротопласт цитопласт деп аталады.
Сурет. Протопластарды бөліп алу. 1968 жылы жапон ғалымы Такебе темекі жапырағынын мезофилл жасушаларынан протопластарды көп мөлшерде алудың тиімді әдісін жете зерттеп дайындады. Алдымен жапырақты 70 %-тік этанолда стерильдейді, кейін 15-20 мин 10 %-тік кальций гипохлоритінде ұстап, дистильденген суда шайып алады. Астыңғы эпидермисті алып тастап, жапырақты майда бөліктерге кесіп, пектиназа ферментінің ерітіндісіне салады. Пектиназа жасуша-аралық қабаттың заттарын ерітеді, яғни мацерация өтеді. Одан кейін объект целлюлаза ферментінін ерітіндісімен өнделеді, бұл кезде целлюлозалық жасуша қабығы біржолата жойылады. Фермент ерітіндісіне осмостық зат қосылады. Осы әдіспен әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларынан протопластар алынады.
Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің коспасын пайдаланады. Бұл қоспаның құрамында ферменттердің үш түрі болады пектиназалар, целлюлазалар және гемицеллюлазалар. Олар жасуша қабығының негізгі компоненттерін ыдыратады. Бұл ферменттерді кейбір бактериялар мен саңырауқұлактар өздерін өсірген сұйық ортаға бөліп шығарады, сонымен қатар оларды ұлудың асқорыту сөлінен бөліп алады. Қазіргі уақытта пектиназалық және целлюлазалық әсері бар бірталай стандарттық ферменттер бар. Олардың фирмалық аттары әр түрлі, атап айтқанда мыналар:
- целлюлазалар
- гемицеллюлазалар;
- пектиназалар:;
- целлокандин мен ксиланаза (бұлар целлюлоза-пектин комплексіне әсер етеді).
Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандырады. Жасуша түрлерінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылықтары болғандықтан, қолданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды. Әрбір ұлпа үшін ферменттердің құрамы, концентрациясы мен ара қатынасы және өндеу уақыты бөлек іріктеліп алынады. Бөлініп алынған протопластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек, одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.
Протопластарды бөлу кезінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады. Протопластар бүтін болу үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болу керек. Кейде материалды алдын ала плазмолиздық ертіндісінде біраз ұстайды. Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза, сахароза, сорбит, маннит) пайдаланылады, кейде СаС12, Ма2НРО4, КСІ тұздардын ерітіндісі 0,3-0,8 М концентрацияда қолданылады. Осмостық заттың дәл концентрациясы өсімдіктің нақтылы түріне және онын физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады. Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады. Ферменттік ерітіндінің рН көрсеткішін бір деңгейде (5,4-6,2) ұстау үшін буфер қосады.
Протопластарды бөлу кезінде аэрацияның маңызы зор. Сондықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітінді түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады. Протопластарды ала көленкеде немесе қараңғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне, рН және температураға байланысты, 1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады. Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өндеу уақытын жеке іріктеп алу қажет. Температура әр деңгейде болады, мысалы бидайға 14°С болса, томатқа ең қолайлысы 27°С.
Протопластар бөлініп алынған сон, олар ұлпаның қалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек. Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады. Инкубациялық қоспаны тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді, одан кейін протопласт суспензиясын центрифугалайды. Центрифугалау тәртібі осмостык затқа байланысты. Егер ферменттік ерітіндісі 0,4-0,5 М сахарозада дайындалса, 100-200 § 2-3 мин бойы центрифугалайды. Протопластар үстіне қалқып шығады, оларды Пастер пипеткасымен сорып алып, екі рет тұздың ерітіндісінде шаяды. Тығыздығы төмен басқа осмостық заттарды (маннит, сорбит) қолданған кезде, протопластар центрифугалау кезінде тұнба болып шөгеді. Оларды екі рет жуады. Одан кейін протопластарды тұздың ерітіндісінде немесе 0,4 М маннит, сорбит, глюкоза ерітіндісіне немесе өсіретін қоректік ортаға салып, суспензиясын алады.
3. Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты. Олар атап айтқанда: ұлпаның шығу тегі (жапырақ, тұқымжарнақ, тамыр, тозаң түйірі, каллус ұлпасы, суспензиядағы жасушалар), өсімдіктің түрі мен сорты, өсімдіктің физиологиялық күйі, ферменттердің құрамы, олардың сапасы, ортаның рН және осмостық заттың түрі.
Протопластардың тіршілікке икемділігін, яғни олардын метаболиттік активтігін анықтайтын арнайы әдіс бар. Ол протопластардын флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы. ФДА - бұл флуоресценциясы жоқ қосылыс, протопластар мембранасы арқылы жеңіл өтеді, тірі протопластардың ішінде эстеразалардың әсерімен ыдырайды. Соның нәтижесінде флуоресцеин босайды, оны протопластардың бүтін мембраналары ұстап қалады. Сондықтан метаболиттік активтігі бар (тіршілікке кабілетті) протопластар ультракүлгін сәулесінде көзге көрінеді, себебі ІІІперінде жинақталған флуоресцеин ультракүлгін сәулесімен коздырылып, жасыл сәулені тарата бастайды.
Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың санымен (процент мөлшерінде) белгіленеді. Протопластардың саны Фукс-Розенталь камерасында есептеледі. Протопластардың тығыздығы (суспензиянын 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы. Егер ұлпаның немесе өсірілген жасушалардың ылғалды массасының 1 граммынан 1005 тен ІхІО'1 дейін тіршілікке икемді протопластар шықса, онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі.
Жоғарыда айтып кеткендей, протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардың өміршендігі өсімдіктің түріне, жасына және физиологиялық күйіне, яғни генетикалық және эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты. Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайлы өсу кезеңін, нақтылы бір мүшесін анықтап таңдап алу қажет.
Іп vitro өскен жасушалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай өз артықшылықтары бар: стерильдік, іп vitro жағдайында өсуге бейімділік. Бірақ жасуша қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және онын калыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады. Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген жасушалардың ішінде меристемалық жасушаларының сан жағынан үлесіне сай болады, ал ол үшін суспензиядағы жасушаларды жиі-жиі (әрбір 2-3 тоулігіпдс) жаңа коректік ортаға көшіріп отыру керек.
Суспензияда өсірген жасушалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мезгіл, ол жасушалардың өсу кезеңінің логарифмдік фазасының соңында. Осы мезгілде жасуша қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап, өміршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке икемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты. Жасушаның плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді. Бұл жағдайда цитоплазманың вакуольденуі артады, көптеген липид тамшылары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядро мен хлоропластар коюланады.
Фермент препаратының сапасы протопластардың бөліп алынған санына, мөлшеріне ғана емес, олардың кейбір қасиеттеріне де әсер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препараттарына қоспа ретінде протеазалар, липазалар, нуклеазалар және басқа ферменттер, фенолдық қосылыстар, тұздар кіреді. Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін. Осы токсикалық заттардан құтылу үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады. Бірақ айта кететін мәселе, өте жақсы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді. Кейде ферменттер ерітіндісіне қорғаушы заттар (протекторлар) қосылады, мысалы декстранның немесе калий сульфатының 0,5 % ерітінділері. Олар протеиндермен әрекеттесіп, ферменттердін зиянды әсерін төмендетеді.
Инкубациялық ортада иондардың әсіресе кальций мен магнийдің болуы, плазмалемманың тұрақтылығын арттырып, оқшауланған протопластардың сапасын жақсартады. Оқшауланған протопластар механикалық және осмостық стреске өте сезімтал болады. Олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде өздерінің осмостық тұрақтылығын сақтай алады.
Ферменттік ерітіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып, біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бұзылған құрылымдарын жөніне келтіріп (репарация), қабығын қайта құруға (регенерация) дайындалады. Толық жарамды изотониялық қоректік ортада (протопласт пен ортаның осмостық қысымы тепе-тең) асептикалық жағдайда протопластар ұзак мезгіл тіршілікке икемді болып, бөлінуге қабілетін сақтайды.
4. Протопластарды іп vitro түрлі тәсілдермен өсіруге болады. Өсіру тәсілі тәжірибенің мақсатына байланысты. Алдымен протопластарды қоректік ортада шайқап жуып ферменттерден тазартады. Сонан соң олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады. Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардың тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді. Ол үшін протопластарды әр түрлі көлемі бар ортаға салады. Мысалы, протопластардың тығыздығын асыру үшін оларды аз көлемді ортаға салады. Ал, керісінше, протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды қоректік орта мол құйылған ыдысқа көшіреді. Сөйтіп, протопластардың 1 мл ортадағы санын оқтын-оқтын есептеу арқылы олардың тығыздығын істейтін тәжірибеге сайма-сай келтіреді.
Протопластарды сұйық ортада өсіргенде жасушаларды өсірген сияқты олардың тығыздығы жоғары болуы керек. Көбінесе бұл көрсеткіш Імл Ю4 - 105 жасуша болады. Егер қоректік орта сұйықталып, протопластар саны бұдан аз болса, онда олар жөнді өсе алмайды. Өте сұйық суспензияда протопластардың ішіндегі тіршілікке қажетті кейбір метаболиттер плазмалемма арқылы ортаға шығып кететін көрінеді. Сондықтан протопластардың тіршіліктік қабілеті едәуір кемиді. Осының дәлелі ретінде мынадай мысал келтіруге болады. Әдетте ісік ұлпалардан алынған жасушаларды суспензияда өсіргенде коректік ортаға ауксин мен цитокинин гормондарын қоспайды. Өйткені бұл гормондар осындай ісік жасушаларының өздерінде түзіледі. Сұйық ортада өсіргенде жасуша кабығы ол гормондардың жасушаның ішінен сыртына шығуын бөгейді де, ондай эндогендік метаболиттерді жасушаның өзі пайдалана алады. Ал ісік жасушалардан бөліп алынған протопластарды суспензияда өсіру үшін қоректік ортаға міндетті түрде экзогендік ауксин мен цитокининді қосу керек. Себебі, жоғарыда айтылғандай, олардың өз эндогендік гормондары жасушаның қабығы болмағандықтан плазмалеммадан шығып кетеді.
Протопластардьщ өсуіне жаксы жағдай жасау үшін «қоректік кабат» әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны колданады, болмаса олар өсіп жаткан ортаньщ көлемін минимумға дейін азайтады. «Астыңғы қоректік қабат» ретінде рентген немесе гамма-сәулелері әсер еткен протопластар мен жасушалар пайдаланылады. Сол әсерден ондай жасушалар бөліну қабілетінен айырылады, бірақ басқа жасушалардың өсуіне жағдай туғызады. Осы әдістің тағы бір түрі, ол нашар өсетін протопластарды жақсы өсетін протопластармен бірге өсіру. Байытылған орталар өсімдіктердің шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.
Протопластарды өсірудін кең таралған әдісі, оларды жоғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкл тамшыларда өсіру. Петри табақшасының қақпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтық пипеткамен салынады. Протопластарды өсіру үшін бұл әдістің тиімділігі - материалдар мен уақытты үнемдеп, қоректік ортаның мыңдаған варианттарын тексеруге мүмкіншілік береді. Бірақ бұл әдістін де кемшілігі бар, ол протопластардың тамшының ортасына жайылуы.
1978 жылы украин ғалымы Ю.Ю. Глеба жеке протопластарды қоректік ортаның көлемі 1 мкл дейін микротамшыларда өсіру әдісін жете зерттеп дайындады және өзінің зерттеу жұмысында осы әдісті нәтижелі қолданды. Осындай көлемдегі микротамшыда бір жасуша болса, онда жасуша көлемі мен қоректік орта көлемінің ара қатынасы әдеттегі өсіргендей тығыздығы 1 миллилитрде 103 жасушасы бар суспензиямен бірдей болады. Протопластарды алдын ала 1-3 күн тығыздығы жоғары (104-105 жасуша) суспензияда өсірсе, кейін сондай суспензиядан алынған жеке протопластарды микротамшыда өсірудің тиімділігі арта түседі.
Протопластарды суспензия ретінде сұйық ортада ғана емес, біраз қоюланған ортада да өсіруге болады. Ол үшін ыдысқа құйылған қоюланған ортаның бетіне жұқа қабат етіп қана протопластарды салады. Бұл әдіс бойынша, сұйық ортамен көлемі тең қоюланған ортада протопластардың концентрациясын екі есе көп етіп өсіруге болады,
Протопластарды агары бар қатты ортада да өсіруге болады. Ол үшін протопластар суспензиясын 1,2 % агары бар жылы (45°С) көлемі бірдей ортамен араластырады. Орта суып қаткан соң оның ішіндегі протопластар бір-бірінен алыстау болып бекітіліп орналасып қалады. Осы агарда орнықтыру әдісі протопластардың әрқайсысының өсуін жеке бақылап отыруға мүмкіндік береді. Агар орнына агароза қолданылса, жасушалардың бөлінуін арттыруға болады екен. Агароза агардың құрамына кіреді, шамасы агар екі полисахаридтің - агароза мен агаропектин - қоспасы. Бұл тәсіл, әсіресе өсу қарқыны бәсең немесе өспей қалған протопластарға қолайлы.
Жасуша қабығы қайта пайда болып, жасушаның алғашқы бөлінуі үшін қоректік заттар орташа мөлшерде қажет болады. Ортаның концентрациясы жоғары болса, протопластардың күй-жағдайы тіпті нашарлауы мумкін. Ал екі-үш рет бөлінгеннен сон жасушалар қоректік заттардың жетіспеушілігінің зардабын шеге бастайды. Егер осы кезде орта байытылмаса, бөлінуі тежеліп, жасушалар тіпті кұрып кетуі де мүмкін. Өсіру кезінде қоректік ортаны байытудың екі жолы бар: жоғары концентрациялы қойылтылған ортаны тамшылап қосып отыру және қатты қоректік қабатты қолдану.
Бірінші жолдын кемшілігі, концентрациясы жоғары ортаны қосқан сайын инфекциялану қауіпі туады. Ал екінші жолы одан тәуірірек, себебі құрамы бай қоректік орта ыдысқа алдын ала қүйылады. Ол қатқан сон үстіне протопластар салынады. Сөйтіп алғашқы күндері протопластар қоректік заттар азырақ ортада өседі, ал кейінірек қаркынды бөлініп келе жаткан жасушаларға астыңғы қатты қабаттан диффузия арқылы қажетті заттар келіп жатады.
Протопластарды да жасушалар мен ұлпаларды өсіретін белгілі қоректік орталарда өсіреді. Протопластарды өсіретін қоректік ортаның негізгі айырмашылығы - кальцийдің концентрациясы 2-4 есе артық және 0,4-0,8 М осмостық заттардың қосылуы. Протопластарды өсіру үшін кеңінен қолданылатын қоректік орталар: өзгертілген Мурасиге-Скуг ортасы (көбінесе ол Нагата және Такебе ортасы деп аталады); Гамборгтың В5 ортасы және Као мен Михайлюктін ортасы (бұл витаминдермен, амин қышкылдарымен және қанттармен, кейде фитогормондардың күрделі құрамымен байытылған Гамборгтын В5 ортасы). Бұнда қанттар (ксилоза, рибоза, целлобиоза, манноза, рамноза) осмотик ретінде ғана емес, жасуша қабығынын тез пайда болуына да әсер етеді.
Өсімдіктердің әр түрлерінен бөлініп алынған протопластардың өсуіне қолайлы көптеген қоректік орталар жете зерттеліп ұсынылды. Қоректік орталарды іріктеп алу көбінесе тәжірибеге негізделген. Оның ең лайықты құрамы өсімдіктің түрі тұрмақ, тіпті жеке сорт үшін де таңдалады. Нақтылы әрбір өсімдіктен алынған протопластардың қоректік ортаға реакциясын зерттеу үшін оларды «аспа тамшылар» әдісімен өсіріп, бірнеше факторлары белгілі схема бойынша әр түрлі комбинацияда құралған қоректік орталарында өсіреді. Мысалы, қоректік ортаның екі факторының үш концентрациясының әсерін зерттеу үшін 9 ортаның 9 варианты дайындалады (яғни 9 тамшы), олар диаметрі 5 см Петри табакшасында үш-үштен тор ретінде орналасады. Бұл тәжірибеде ең азы 5 табақша қолданылатын болғандықтан, қосымша факторлардың, мысалы жарық пен температураның әсерінде зерттеуге әбден болады. Протопластарды осіргендегі температура өсімдіктің түріне байланысты 15°С-тан 30°С-қа дейін болады. Әдетте протопластар температураға өте сезімтал. Жарықтың қарқыны 0-ден 2000 люкске дейін болады.
5. Ең бірінші болып 1971 жылы Такебе протопластарды нәтижелі өсіріп, олардан өсімдіктерді шығаруға болатындығын дәлелдеді. Лайықты жағдайда протопластар жасуша қабығын қайта түзіп, кәдімгі нағыз жасушаға айналады. Электрондық микроскоп көрсеткендей, өсімдік протопластарының сыртқы қабатында 10-20 минут өткен сон бірінші целлюлозаның микрофибрильлері пайда болады, ал 20 сағаттан кейін олар қабықтың тығыз торын түзеді. Жасуша қабығының плазмалеммамен байланысының бұзылуы, шамасы, бірден қабықты қайта құру механизмін іске қосады. Ең қызығы, қабығынан айырылмаған плазмолизге ұшыраған протопластың үстінде жаңа қабықтың түзілгені. Қабықтың түзілуінің ерекшеліктері және жылдамдығы бастапқы жасушаның түріне және дифференцировкасына байланысты.
Алқа, крестгүлділер, шатыршагүлділер тұқымдастар өсімдіктерінің протопластары жасуша қабығын 24 сағат ішінде түзеді. 24-36 сағаттан кейін жасушалар бірінші рет бөлінеді, ал 3-4 апта өткен сон каллус жасушаларының колониясы түзіледі. Өсіру кезінде біртіндеп (2 аптадан кейін) ортаның осмостық қысымын төмендетеді, соның нәтижесіңде бөліну жылдамдығы өседі. Содан кейін каллустарды регенерация өту үшін қатты ортаға көшіреді. Каллуста морфогенездің (органогенез) басталуы, яғни өркен мен тамырлар түзілуі регенерант өсімдіктер пайда болуына әкеледі.
Талай өсімдіктердін протопластары сомалық эмбриогенез арқылы да регенерант өсімдіктер түзеді. Оқшауланған протопластардан пайда болған жасушалардың бөлінуге және тотипотенттілігін жүзеге асыруға қабілеттері көптеген факторларға тәуелді:
1) бастапқы ұлпаның түр ерекшелігі, физиологиялық күйі және дифференцировкасы, яғни генетикалық және эпигенетикалық сипаттамасы;
2) протопластарды бөліп алу әдістері мен жағдайлары;
3) протопластарды суспензияда өсіргендегі тығыздығы;
4) қоректік ортаның құрамы;
5) протопластарды өсіру жағдайлары.
Бақылау сұрақтары: Оқшауланған протопластарға жасушалык инженерия әдісі.
Протопластарды іп vitro тәсілімен өсіру әдістері.
Оқшауланған протопластардан пайда болған жасушалардың бөліну және тотипотенттілігік қабілеттері.
