Дипломдық ЖҰмыс 5B070100 -«Биотехнология мамандығы»
Бір пробиркаға арналған Микс
жүктеу/скачать 3,33 Mb.
|
| Бір пробиркаға арналған Микс:
- 35 мкл PNM-жиынтықта келеді 5 мкл инкубацияға арналған 10 есе полимеразды буфер-берілмейді х мкл ерітінді MgCl21) - жеткізілмейді ТЕРМОСТАБЕЛЬДІ ДНҚ полимеразасының 1-2 бірлігі мкл су көлемін 45 мкл дейін жеткізу үшін (фермент көлемін есепке алмағанда) - жеткізілмейді50 мкл соңғы көлемін алу үшін 5 мкл ДНҚ ерітіндісін (20-100 нг ДНҚ) қосыңыз (фермент көлемін қоспағанда).Қолданылатын фермент/буфер жүйесіне байланысты MgCl2 оңтайлы концентрациясы. ол 1.5 және 2.5 мМ аралығында өзгеруі мүмкін. Кейбір инкубациялық буферлерде MgCl2 бар екенін ескеріңіз. Бұл күшейту қоспасындағы MgCl2 соңғы концентрациясы 2.5 мМ құрайды. Амплификациялау үшін үлгілердің саны анықталады (талданатын сынамалардың саны + бақылау үлгілері). Контаминацияны бақылау сынамасында, мысалы, ДНҚ ерітіндісінің орнына 5 мкл су болады. ДНҚ ерітіндісінен басқа барлық реактивтер бар мастер-микс дайындап, жақсылап араластырдық (вортексте емес). Әрбір дайындалған ПТР-пробиркаға 45 мкл (кесте 12). Тексеру үшін қолданылатын taq полимеразасына қатысты: егер белгілі бір ыстық бастау ДНҚ полимеразасы қолданылса, бірінші кезеңге кететін уақытты азайту керек. Күшейту реакциясын тексеру үшін әр үлгінің 5 мкл-ін буфер қоспай 2% агарозды гельге тікелей қолдануға болады.. Ампликондардың ұзындығы шамамен 230 базалық жұпты (текті бақылау) және 200 базалық жұпты (әмбебап бақылау/түрге тән фрагмент) құрайды. Кесте 12 Күшейту бағдарламасы:
Будандастыру. Дайындау Су моншасын шайғышпен алдын ала қыздырамыз 45°C дейін.температураның рұқсат етілген максималды ауытқуы ±1°C. HYB m STR ерітінділерін алдын-ала 37-45°C дейін қыздыру керек.CON-C және SUB-C қоспағанда, қалған ерітінділерді бөлме температурасына дейін жеткізіңіз. Тиісті пробиркада коньюгат концентратын (CON-c - қызғылт сары) және субстрат концентратын (SUB-C - сары) 1:100 қатынасында тиісті буфермен (con-C con-D, SUB-C SUB-D) қажетті мөлшерде сұйылтыңыз. Жақсылап араластырыңыз және бөлме температурасына дейін жеткізіңіз. Әр жолақ үшін есептеуден: тиісті буфердің 1 мл-ге 10 мкл концентрат қосыңыз. CON-c әр қолданар алдында өсіріледі. Сұйылтылған SUB-C бөлме температурасында 4 апта бойы жарықтан қорғалған жерде сақталуы мүмкін. Әр ұяшықтың бұрышына 20 мкл денатурация ерітіндісін (DEN, көк) қосамыз! Ерітіндіге 20 мкл күшейту өнімін қосыңыз, тамшуырмен араластыру және бөлме температурасында 5 минут инкубациялаймыз. Осы уақытта пинцетпен түтіктен стриптерді алып тастаймыз және оларды түрлі-түсті жолақтың астына қарындашпен қол қою. Әр ұяшыққа алдын-ала қыздырылған будандастыру буферінің (HYB, жасыл) 1 мл мұқият қосамыз. Біртекті бояу алынғанша ваннаны ақырын шайқаңыз. Ерітінді көрші ұяшықтарға түспейтініне көз жеткізу. Жолақтарды ұяшықтарға салу.Жолақтарды толығымен батыру керек, ал жұмыс жағы (төменгі ұшындағы түрлі-түсті жолақпен анықталады) жоғары қаратып тұруы керек. Егер жолақ төңкерілген болса, оны пинцетпен түзету керек. Контаминацияны болдырмау үшін пинцетті әрбір қолданғаннан кейін мұқият жуу керек. Бұл тесттің барлық келесі кезеңдерінде маңызды. Ваннаны шайғышпен су ваннасына салыа , 45°C температурада 30 минут инкубациялау, сұйықтық үнемі араласып, бірақ көрші жасушаларға түспеуі үшін су ваннасының шайқау жылдамдығын орнатыңыз. Температураның біркелкі таралуын орнату үшін ванна биіктіктің 1/3 бөлігіне батырылады.Будандастыру буферін толығымен аспирациялау қажет. Мысалы, вакуумдық сорғыға қосылған Пастер тамшуырын қолдануға болады. Әр жолаққа 1 мл Қатты жуу ерітіндісін (STR, қызыл) қосу және шайғыш су ваннасында 45°C температурада 15 минут инкубациялау. Қатты жуу ерітіндісін толығымен алу керек. Ерітінді үшін контейнер қалдықтарды жою.. Жуудың келесі кезеңдерінде де солай жасау.Әр жолақты 1 мл жуу ерітіндісінде (RIN) шайғыш платформасында 1 минут жуу. Әр жолаққа 1 мл сұйылтылған конъюгат қосу және шейкер платформасында 30 минут инкубациялау (сурет 15). жүктеу/скачать 3,33 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|