Дипломдық ЖҰмыс биополимерлерді синтездеудің микробиологиялық жолдарын зерттеу 5В070100-«Биотехнология» мамандығы
жүктеу/скачать 2,32 Mb.
|
1.6.1 Бактерияларды өсіру жағдайлары және полимердің жинақталуы. Периодтық жүйелер. Орташа тізбекті полигидроксиалканоат синтездейтін бактериялардың көпшілігі, жасушалардың өсуі керекті қоректік заттардың, мысалы, N, P,Mg,K,O,немесе S шектелуі негізінде тоқтаған кезде, артылған көміртектің қатысуы арқылы полигидроксиалканоат жинай бастайды [92]. "Қоректік аштық" деген ұғым осы уақытта ең жақсы анықтама болып табылады, өйткені жасушалар саны көбеймейді, бірақта қажетті биомасса полигидроксиалканоат жинақталуының негізінде жақсы өседі. Көптеген жағдайларда мерзімді өсіру екі фазалы ферментация түрінде жүзеге асырылып жатыр. Бірінші фазада бактериялар жасушалардың ең жоғарғы тығыздығына дейін өседі, бұл үшін минимальды қоректік ортаны пайдалана алады. Екінші фазада полигидроксиалканоат жинақтау үшін культураға тек көміртекті субстрат көзі қолданылады және культураға өзге қоректік элементтер, фосфор немесе азот жетпейді. Себебі жинақтау бұл сызықтық процесс болып табылады, онда көміртегі бактериялар полигидроксиалканоаттарды жинауы үшін жасушаны керекті энергиямен қамтамасыз ету үшін сызықтық жылдамдықпен түседі. Бұл жерде басты модельден ауытқулар бар, әсіресе, жасушалардың жоғары тығыздығымен культивирлеу процестері үшін, бірінші фаза да екі кезеңге бөлінеді, мерзімді өсіру кезеңі және полигидроксиалканоаттарды жақсы жинақтамайтын мерзімді өсіру кезеңі [93].
Зерттеу нысаны мен әдістері Эксперименттер Еуразия Ұлттық университетінің зертханасында гетеротрофты жағдайларда қатаң стерильді түрде арнайы шарттарды ұстана отырып жүргізілді. 2.1 Сутегі бактериялары Cupriavidus eutrophu Bacteria Домені Proteobacteria Филумы Proteobacteria Класы Burkholdeviaceae Туысы Cupriavidus Туысқандығы Түрі C.eutrophus C.eutrophus B-10646 штаммы C.eutrophus Штаммының культуральды-морфологиялық ерекшеліктері: грам «-», формасы таяқша пішінді жасушалар, жас бактериялар – қысқа, стационарлық фaзaдағы бактериялар – әртүрлі ұзындықта болады, өлшемдері 0.2-0.5х1-2 мк, қозғалғыштығы жағынан жас бактериялар – монотрихтер, ал ересектер бактериялар – перетрихтер болып табылады. Өсу үшін оптимум температурасы 30-31°C, рН 6,7-7,2 болып табылады. Пептон қосылған агарланған қоректік ортада өсудің гетеротрофты жағдайларында ашық түсті, диаметрі екіден төрт мм-ге дейін кішкене толқынды шеті бар мөлдір емес морфологиялық біртекті дөңгелек шар тәрізді колониялар түзеді. Минералды агарланған қоректік ортада өсудің автотрофты жағдайларында ұсақ диаметрі 1,5-ден 2,5 мм-ге дейін, ашық және сұр түсті, жартылай мөлдір колониялар түзеді. Сұйық қоректік ортада сүт-кремді түсті біртекті суспензия түзеді. Облигациялық аэробтты, факультативтік хемолиавтотрофты болып келеді. Оксидазаға «+» реакция көрсетеді. Гидролитикалық ферменттері жоқ. Желатинді сұйылпайды, крахмалды гидролиздемейді. Құрамында қанттардан глюкоза мен фруктоза, амин қышқылдардан лизин, серин, аланин, лейцин, гистидин, триптофан, глутамин, аспарагин, гистидин органикалық қышқылдардан май қышқыл, лимон, янтар, шавель, фумар, сірке суы, пентан, гексан, октан, нонан, спирттрден глицерин мен этанол, төрт-буторолактан, көміртегі және СО бар. Өсу сипаттамасы: штамм қант немесе органикалық қышқылдары бар минералды қоректік ортада, сонымен қатар сутегі атмосферасында, көміртегі мен оттегінің қос тотығында жақсы өседі. Өсудің ерекше факторлары мен органикалық қоспаларды қажет етпейді. Физиологиялық әсерінің шектері 4,4-тен 8,6 аралығындағы РН, көміртегі мен энергия көзін алмастыру, ортаның белсенді реакциясының төмен немесе жоғары мәндерінің өзгеруі, температураның 35°C дейін көтерілуі, бойлық токсикалық субстрат ретінде төрт-бутуролактон және монокарбон қышқылдарының тұздары өз қажетіне қолдану кезінде штамм өзінің қасиеттерін сақтай алады. Сонымен, айтылған штаммға тән: - әртүрлі құрамдағы қоректік ортада тұрақты жақсы өсу қасиеті; - жоғары өнімді полигидроксиалканоат синтезіне айтарлықтай жоғары қабілеттілігі; - лиофилизацияланған түрде белсенділігін ұзақ сақтау қабілеті; - полигидроксиалканоат синтезіне жауап беретін арнайы ферменттердің жоғары белсенділігі; - Гетерополимерлі полигидроксиалканоат синтезінің с-субстрат стимуляторларының әсеріне жақсы төзімділігі; - гетерополимерлі полигидроксиалканоат синтезіне қабілеттілігі; - 50%-дан аз кристалдылық дәрежесі бар полигидроксиалканоат синтезіне қабілеттілігі. Cupriavidus eutrophus штаммы өнеркәсіптік микроорганизмдердің Бүкілресейлік коллекциясында сақталады, В-10646 оның коллекциялық нөмірі.
Бактерияларды өсіру үшін негіз ретінде мынадай құрамдағы Шлегельдің тұзды қоректік ортасы қолданылды: Na2HPO4 х H2O – 9,1; KH2PO4 – 1,5; MgSO4 х H2O – 0,2; Fe3C6H5O7 х 7H2O – 0,25; NH4Cl – 0,2-1,0 [Schlegel et al., 1961]. Темір көзі ретінде лимонқышқылды темір (бес г/л) ерітіндісі қолданылды, ол бес мл/л мөлшерде қосылды. Микроэлементтерді Хоагландтың жазбасы негізінде бір литр қоректік ортаға үш мл стандартты ерітінді қостық. Стандартты ерітіндінің құрамы: H3BO3-0.288; CoCl2 х 6H2O – 0.030; CuSO4 х 5H2O – 0.08; MnCl2 х 4H2O – 0.008; ZnSO4 х 7H2O – 0.176; NaMoO4 х 2H2O -0.050; NiCl2 – 0.008 (г/л) бар. Азот көзі ретінде хлорлы аммоний мен несепнәр пайдаланылды. Суpriavidus eutrophus В10646 штаммы үшін гетеротрофты өсіруде субстрат көзі ретінде глицерин пайдаланылды, оның бастапқы концентрациясы он-он бес г/л , ал культурада бес г/л. Зерттеу үшін негізгі С-субстрат көзі ретінде шығу тегі және әр түрлі тазалық дәрежесі бар үш түрлі глицерин қолданылды: глицерин-I 99,3% глицерин-II 99,7% глицерин-III 82,07%
Бактериялар мерзімді режимде өсірілді. Өсіру көлемі бір литр және екі литр шыны құтыларда термостатталатын шейкер-инкубаторларды пайдалана отырып, жартылай 50% толтырумен жүргізіледі (7-сурет). 7-сурет. Термостатталатын шейкер. Бактерияларды тереңдік мерзімді өсіру үшін құрылғы көлемі отыз литр, жұмыс көлемі онннан жиырма литрге дейінгі NLF 22 сериялы Bioengineering фирмасының пилоттық ферментерлері және көлемі жүз елу литр, жұмыс көлемі елуден жүз литрге дейінгі автостерильді сүзгіші бар P сериялары ферментерлері қолданылады (8.9 сурет). 8-сурет. Өзі стерилизациялайтын ферментер көлемі 30 л Bioengineering. 9-сурет. Өзі стерилизациялайтын ферментер көлемі 150 л Bioengineering. Бактерияларды ПГА биосинтезі үшін даярланған арнайы шарттарды сақтай отырып өсіреді [Волова с соавт., 1992]. Инокулят егіс материалы ретінде хемоорганотрофты сутегі тотықтырғыш бактериялар штаммдарының музейлік культураларын қолдандық, олар 5°С температурада Шлегельдің агаризацияланған қоректік ортасында сақталады. Бактерияларды Шлегельдің тұзды қоректік ортасында рН 7,0 кезінде, глицериннің бастапқы концентрациясы 10-15 г/л және орта температурасы 30°С кезінде культивирлеу процесі жүргізілді. Кезеңдік екі сатылы процесс қолданылды. Бірінші кезеңде жиырма-жиырма бес сағат өсудің оңтайлы жағдайларында жасушалардың биомассасы 120 мг/г құрайтын, құрамында азот бар бактериялардың физиологиялық қажеттілігінен екі есе азайтылған ортаны пайдаланылды. Азот көзі ретінде несепнәр қолданылды. Екінші кезеңде жиырма-отыз сағаттық процесс сол параметрлерде, бірақ азотсыз ортада жалғасты. Жоғары тығыздықты ферментациялық культураларда С-субстрат концентрацияланған ерітінділерін және минералды элементтерді культураларға беруді перистальтикалық насос дозаторлар көмегімен жүзеге асырылды. 2.4 Культивирлеу кезіндегі бақылау параметрлері. Кинетикалық және продуктивтік сипаттамалары Бактерияларды культивирлеу барысында әр төрт-алты сағат сайын сынама алып, фотоэлектрокалориметрде культураның оптикалық тығыздығы анықталды. Тестілеу үшін сынаманы бірдің беске, бірдің жиырмаға және бірдің елуге қатынасындай пропорциясында дистилденген сумен сұйылтамыз, өлшеулер толқын ұзындығы λ = 440 нм болғанда бір мм кюветтерде өткізіледі. Әдіс мыналардан тұрады: белгілі бір көлемнен тұратын культураларды центрифугада 6 мың айн/мин он минут ішінде айналдырылды. Ішінен супернатантты алып тастап, ал жасушалардың шөгінділерін дистилденген сумен жасушаларды екі рет жуып, қоректік ортаның қалдықтарын жою үшін арнайы көрсетілген жағдайларда центрифугалау арқылы жинаймыз. Жуылған жасушаларды бюкстерге апарып, 105ºC температурада тұрақты салмаққа дейін 1 күн бойына кептіреді. Эксикаторда салқындатылғаннан соң сынамалар өлшенді. Бактериялық биомассаның салмағы кептірілген жасушалы бюкс салмағы мен бюкстің бастапқы салмағы арасындағы айырмашылығынан алынды. Культурадағы бактериялардың биомассасын электрондық таразы әдісі арқылы анықтадық. Бактериялық культуралардың тазалығын пептонды агарға сынамаларды егу арқылы жүзеге асырылды. Оның құрамын жиырма грамм агар, он грамм пептон, бес грамм 2,5% натрий хлориді бір литр дистилденген суға салып жасаймыз. Культивирлеу стандартты әдіс негізінде жүргізілді [94]. 33ºC температурада термостатқа қойылып, егілді. [Егоров, 1976] 2.4.1 Глицерин концентрациясын анықтау Глицерин концентрациясын формальдегидке дейін күкірт қышқылы ерітіндісінде натрий периодатымен глицериннің тотығуына және хромотропты қышқылы бар колориметриялық әдіспен анықтауға негізделген әдіс арқылы анықталды [Nakamura et al., 2016]. Анықтау әдісі келесідей сатылардан тұрады: екі мл культураларды 6 мың об/мин кезінде екі минут бойына центрифугалайды; содан соң жиырма мкл супернатантты пробиркаға салып, он мл дистилденген су қосады; одан кейін әзірленген сынаманың екі мл таза пробиркаға салады, және бақылау пробиркасына екі мл дистилденген су қосады; екі пробиркаға 0,1 мл күкірт қышқылы және 0,5 мл NaІО4 қосады; бес минут ұстап тұрып, 0,5 мл NaHSO3 қосады; бір мл ұнтақталған шлифпен бес мл хромотроп қышқылын қосады, сосын шыны қақпақтармен бетін жабады және жарты сағат бойы қайнаған су буында қыздырады; содан соң пробиркалар бөлме температурасына дейін салқындатылады және оптикалық жолдың ұзындығы бес мм, λ = 570 нм болғанда фотоэлектрокалориметрде оптикалық тығыздықты өлшейді. Глицерин концентрациясын алдын ала даярланған калибрлеу кестесі негізінде анықтайды.
Әдістері: - Сапалы әдіс; Азоттың құрамын анықтау үшін он мл дистилденген суға бір мл фугат, сілтінің тамшысын, яғни 33%-ші калий гидроксиді ерітіндісін және 0,5 мл Несслер реактиві қосамыз. Нәтижесінде алынған ерітінді азот құрамына байланысты өз түсін өзгертті. Бояу стандарттармен визуальды түрде салыстырылды. - Сандық әдіс; Азот құрамын анықтау үшін супернатант жүз есе сұйылтылды. Он мл бұл ерітіндіге сілті тамшысын, яғни 33% калий гидроксиді ерітіндісін және 0,5 мл Несслер реактивін қостық. Бақылау ретінде дистильденген суды пайдаландық. Оптикалық тығыздықты 400 нм толқын ұзындығы кезінде фотоколориметрде өлшедік (оптикалық жолдың ұзындығы он мм). 2.4.3 Жасушалардағы ПГА құрамын анықтау Жасушаішілік концентрациясы мен полигидроксиалканоат құрамы хромато-масс-спектрометрінде үлгілердің алдын ала метанолизінен кейін май қышқылдарының метил эфирлерінің хроматографиясы құрылғысы арқылы анықталды. Полимер сынамасының метанолизі келесідей жүргізілді: құрғақ биомассаның ілуіне (3,9-дан 4,5 мг-ге дейін) бір мл ішкі стандартты (0,5 мг бензой қышқылы\бір мл хлороформ), 0,85 мл метанол және 0,15 мл концентрацияланған күкірт қышқылы қосылды және 2 сағат 40 минут ішінде кері тоңазытқыштармен қайнатылды. Метанолиз аяқталғаннан соң колбаға дистилденген судың бір бөлігін қостық. Нәтижесінде сұйықтықтардың бөлінуі болды. Төменгі хлороформ қабаты хроматография құрылғысында талдау үшін пайдаланылды. 2.4.4 Культуралық ортада органикалық қышқылдардың концентрациясын анықтау 1,5 мл бактериялық суспензияны 10 минут бойына 6 мың g кезінде центрифугада айналдырамыз. Шөгінді сұйықтықты өлшеу пробиркасына салып және рН-қа тұз қышқылының 30% ерітіндісін қосып екі-үш дейін жеткіземіз. Содан кейін әрбір пробиркаға үш мл хлороформ қосамыз. Органикалық қышқылдардың концентрациясы полимердің құрамын анықтау үшін ұқсас жағдайларда GCD plus Hewlett Packard хромато-масс-спектрометр аппаратының көмегімен анықтаймыз. 2.4.5 ПГА физикалық қасиеттерін анықтау Полимердің молекулалық салмағын және молекулалық массалық таралуын Agilent Technologies гель-өткізгіш хроматография құрылғысын қолдана отырып анықтадық. Биополимердің температуралық сипаттамалары DSc-1 MettlerToledo дифференциалды сканерлеу калориметр құрылғысын қолдана отырып анықталды. 2.5 Микробиологиялық зерттеу 2.5.1 Инокулят және қоректік ортаның стерильдігін тексеру Инокулят пен қоректік орталардың стерильділігін тексеру үшін сынамаларды іріктеу және агаризацияланған ортаға егу керек. Микробиологиялық бақылауға арналған сынамалар инокулятты даярлау кезінде, термостатқа қойылған кезде және 24 сағаттан кейін алынды. Микробтық культураларды егумен және оларды бөліп алумен байланысты барлық манипуляциялар қатаң стерильді жағдайда арнайы шарттарды қолдана отырып жүргізіледі. Егер алдында барлық ыдыстардың бүтіндігі тексеріледі және автоклавта 120 градус температурада қырық минут бойына стерильденеді. Бактерияларды егу үшін пептонды агар (ПА) қоектік ортасы қолданылады. Микробиологиялық бақылау бойынша жұмыс төрт сатыдан тұрады: - егу үшін тығыз қоректік ортаны даярлау; - егетін ыдыстарды даярлау; - Петри тостағаншасындағы қоректік ортаға культураны себу; - өскен колонияларды микроскоп құрылғысының астында бағалау. Cupriavidus eutrophus B-10646 штаммының бактериялары диаметрі екіден төрт мм-ге дейін аз ғaна толқынды шеті бaр ашық түсті, мөлдір емес оқшауланған морфологиялық біртекті дөңгелек шар тәрізді колония түрінде көрінеді. Егілген сәттен бастап сегіз күннен соң немесе қайта егілген сәттен бастап бес күннен соң басқа микроағзалар жоқ культуралар сынамалары стерильді болып саналады. Бактерияларды анықтау үшін қоректік агар, саңырауқұлақтарды анықтау үшін – Сабуро қоректік ортасын пайдаландық. Бактерияларды анықтау үшін "Берджи бактерияларын анықтаушы" пайдаланылды, фенотиптік сипаттамалары талданды: морфологиялық – формасы, түсі, мөлшері, жасушалардың өзара орналасу ерекшеліктері; тинкториялық – граммен бояу сипаты; спораның пайда болу қабілеті; қозғалғыштығы зерттелді. 2.5.2 Сабуро қоректік ортасын дайындау Сабуро қоректік ортасы – ашытқы саңырауқұлақтарын және зең саңырауқұлақтарын өсіру үшін пайдаланылатын қоректік орта. Құрғақ, ұсақ дисперсті гомогенді, гигроскопиялық, ашық сары түсті жарық сезгіш ұнтақ болып келеді. Құрамы (дайын ортаға бір литр):
Ферментативті құрғақ пептон - 7 грамм. Ферментативті соя ұнының гидролизаты - 3 грамм. Кристалды гидратты глюкоза – 40 грамм. Автолизирленген ашытқы сығындысы - 4 грамм. Микробиологиялық агар (тығыз қоректік орта үшін) - 12 грамм Ашытқы саңырауқұлақтарын, зең саңырауқұлақтарын және ацидофильді бактерияларды культивирлеуге арналған, сонымен қатар сыртқы орта объектілерін санитариялық текcеру кезінде қолданылатын сұйық немесе тығыз қоректік орта. Сұйық ортаны әзірлеу: Елу төрт грамм құрғақ ортаны бір литр дистильденген суға ерітіп, қайнатып, толық ерігенше бір-үш минут бойына қайнату қажет, суытып, рН 5,5-5,7 болатындай түзету керек. бес мл-ден стерильді таза пробиркаларға құю керек. 112°С температурада 20 минут бойына автоклавта стерильдеу қажет. Дайын орта мөлдір, ашық сарғыш болуы шарт. Дайын болған сұйық ортаны пайдалануға дейін қараңғы жерде 2-8°С температурада он күннен артық сақтауға болады. Тығыз ортаны дайындау: Алпыс алты грамм құрғақ ортаны бір литр дистильденген суға ерітіп, қайнатылды, толық ерігенше бір-үш минут бойы қайнатылды, суытып, рН 5,5-5,7 болатындай түзетілді. Агарды толық ерітуге дейін қайтадан жеткізу, керек болған кезде мақта-дәке сүзгісі арқылы профильдеу қажет. Ортаны 50°С температураға дейін суытып, стерильді Петри тостағандарына құйыңыз. Асептикалық жағдайда 90 минутқа кептіруге қою керек және кептіруге арналған бөлме температурасында шыныаяқ ыдыстардың бетін ашық қалдыру қажет. Дайын орта мөлдір, ашық сарғыш болуы керек. Дайын болған Сабуро қоректік ортаны пайдалануға дейін қараңғы жерде 2-8°С температурада он күннен аспайтын уақытта сақтауға болады. 2.5.3 Граммен бояу әдісі
3.Зерттеу нәтижелері және оны талдау 3.1 Бактерияларды колбаларда өсіру нәтижесі. Инокулятты әзірлеу. Бактерияларды полигидроксиалканоаттар синтездеу процесі үшін даярланған арнайы жағдайларда өсірдік. Егетін материалдарды қатаң стерилизацияланған жағдайда агаризацияланған қоректік ортада сақталған культураны ресуспендиялау жолымен алдық (10-сурет). Ары қарай культураны сұйық ортада бір литр культураға он-он бес г/л глицерин концентрациясы бар Шлегель қоректік ортасында өсірдік. а) инокулят пробиркада б) литрлік колбаларда 10-сурет. Агаризацияланған ортада сақталған Cupriavidus eutrophus B-10646 штаммының бактериялары бар пробирка мен колбалар.
Бактерияларды арнайы шарттарды сақтай отырып өсірдік [Волова с соавт., 1992]. Инокулят ретінде хемоорганотрофты сутегі тотықтырғыш бактериялар штаммдарының музейлік культураларын пайдаландық. Олар 5°С температурада Шлегельдің агаризацияланған қоректік ортасында сақталады. Бактерияларды Шлегельдің тұзды қоректік ортасында рН 7,0 шамасында, глицериннің баcтапқы концентрацияcы 10-15 г/л және орта температурасы 30°С кезінде культивирлеу процесі жүргізілді. Кезеңдік екі сатылы процесс қолданылды. Бірінші кезеңде 20-25 сағат өсудің оңтайлы жағдайларында жасушалардың биомассасы 120 мг/г құрайтын, құрамында азот бар бактериялардың физиологиялық қажеттілігінен екі есе азайтылған ортаны пайдаланылды. Азот ретінде несепнәр қолданылды. Екінші кезеңде 20-30 сағаттық процесс сол параметрлерде, бірақ азотсыз ортада жалғасты. 3.2 Инокулят пен қоректік орталардың стерильділігін тексеру нәтижесі Бактериялық культуралардың стерильдігін тексеру пептонды агарға сынамаларды егу арқылы жүзеге асырылды. Культивирлеу стандартты әдіспен жүргізілді. 33ºC температурада термостатқа салып, егілді. [Егоров, 1976] Микробиологиялық тексеруге арналған сынамалар инокулятты дайындау кезінде, термостатқа қойылған кезде және 24 сағаттан соң алынды. Бактерияларды қоректік ортаға егу және оларды бөліп алу қатаң стерильді жағдайда арнайы шарттарды сақтай отырып жүргізілді. Егу алдында қолданылатын ыдыстардың бүтіндігі тексерілді. Автоклавта 120ºC температурада 40 минут бойына стеризацияланды. Бақылау бірнеше жолдардан тұрды. Алдымен қоректік ортаны жиырма грамм агар, он грамм пептон, бес грамм 2,5% натрий хлориді бір литр дистилденген суға салып дайындап алдық. Ал саңырауқұлақтар үшін Сабуро қоректік ортасын пайдаландық. Екінші кезекте керекті ыдыстaрды кептіргіш шкафтар мен автоклавта стерильдеп, бүтіндігін тексеріп дайындап алдық. Петри табақшасына қоректік ортаны салып, оған культураны егіп алдық. 33ºC температураға термостатқа қойылды. Нәтижесі микроскоп құрылғысының көмегімен бақыланды (3-кесте). Cupriavidus eutrophus B10646 культураларда, инокулятты және өндірістік культураларды қосқанда, бөгде микрофлора микробиологиялық зерттеулер нәтижесінде анықталмады. Колониялардың біртектес макрофотографиясы және культураларды микроскопиялау нәтижелері контаминацияның болмауына дәлел бола алады (11 сурет). а) макрофотография б) микроскопиялау 11-сурет. Колониялардың біртектес макрофотографиясы және микроскопиялау
Cupriavidus eutrophus B-10646 лиофильді-кептірілген биомассасын зерттеу барысында Bacillus тектес және Micrococcus тектес бактериялардың 3,7% микрофлорасы анықталды, бұл биомассаның зертханадағы ауа ортасымен байланысымен байланысты. Зең саңырауқұлақтары, ішек таяқшасы тобының өкілдері мен сальмонелла анықталған жоқ. Нәтижелері 4 кестеде көрсетілген. 4-кесте. Cupriavidus eutrophus B-10646 лиофильді кептірілген биомассасының микрофлорасы
3.3 Берджи бойынша анықтама нәтижесі Культуралды-морфологиялық ерекшеліктері: -фоcмасы таяқша пішінді, жас бактериялар – қысқа, стационарлық фазада – әртүрлі ұзындықта болады. - Өлшемдері 0.2-0.5х1-2 мк. - Қозғалғалғыштығы жағынан жас бактериялар – монотрихтер, ересектер бактериялар – перетрихтер болып келеді. - Өсу үшін оптимум температурасы 30-31°C болып табылады, - рН 6,7-7,2 тең. Грамм әдісімен бояу нәтижесінде бактериялар қызғылт түске боялды. Соның арқасында грамм теріс екені анықталды. Бактерия классификациясы 5 кестеде көрсетілген.
3.4 ПГА өнімінің жалпы сипаттама нәтижесі Жасушадан бөлінген полигидроксиалканоат биомассасын лиофильді кептіргіштерде кептіріп, экстракция процесін жүргіздік. Экстракцияны екі сатыда жүзеге асырдық: бірінші сатыда биомасса этил спиртімен майсыздандырылды, екінші сатыда полимерді хлорлы метиленмен экстрагацияладық. Бұдан кейін полимердің ерітіндісін жасушалық қабырғалардан сүзіп алып, полимерді этанол көмегімен тұндырдық. Полигидроксиалканоаттар физико-химиялық қасиеттерін зерттеу үшін ұнтақ түріндегі полимердің үлгілері қолданылды. Полигидроксиалканоат өнімін зерттеу нәтижелері 6-кестеде көрсетілген. 6-кесте. Полигидроксиалканоат өнімінің сипаттамасы
Қорытынды Жүргізілген эксперименттер нәтижесінде Еуразия ұлттық университетінің зертханасында гетеротрофты жағдайларда Сupriavidus eutrophus B10646 бактерияларынан полимердің культурадағы штамм - продуценттің өсуі және шығуы зерттелді.
Жұмыс барысында Cupriavidus eutrophus в10646 бактериясының биологиялық сипаттамалары зерттеліп, культуральдық – морфологиялық ерекшеліктері: грам «-» екендігі, формасы таяқшалы екендігі, өсу үшін оптимум температурасы 30-31°C, рН 6,7-7,2 өсетіндігі және диаметрі 2-ден 4 мм-ге дейінгі кішкене толқынды шеті бар мөлдір емес морфологиялық біртекті шар тәрізді колониялар түзетіндігі анықталды. Cupriavidus eutrophus в10646 бактериялардағы полимердің өсуі мен жиналуы зерттелді. Зерттелетін штамм полигидроксиалканоаттардың биополимерін синтездеуге қабілетті екендігі анықталды. ПГА полигидроксиалканоаттардың жалпы физико-химиялық қасиеттері зерттеліп, фазалық күйі - құрғақ зат, сыртқы түрі - ақ түсті үлпек, құрамы, балқу температурасы - 150-ден 170 градусқа дейін, термиялық деградация температурасы - 260-ден 300 градусқа дейін, криссталдану дәрежесі - 55-ден 60 пайызға дейін, тығыздығы - 1160-ден 1200 кг/м3 дейін, молекулалық массасы - 306-ден 406-ға дейін кДа болатындығы анықталды. Пайдаланылған әдебиеттер Саin R.B. Microbial degradation of synthetic polymers / In: Frey J.C, Gadd G.M, Herbert R.A, et al // 48 symposium of the society for general microbiology: Bath. Press. – UK, - 1992. – 293-338 P. Witt U. Biodegradation of polyester copolymers containing aromatic compounds / U Witt, R.J Meller et al // J.M.S Pure Appl. Chem., 1997. – Vol.32. –851-856 P. Вторичные ресурсы: проблемы, перспективы, технология, экономика: Учебник, пособие / Г. К. Лобачев [и др];– Волгоград. – 1999. – 180 С. Anderson A.J. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates / A.J Anderson, E.A Dawes // Microbiol. Rev., - 1990. – Vol.54. – 450-472 P. Doi Y. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4hydroxyvalerate) / Y Doi, M. Kunioka // Macromolecules, - 1990. - Vol.23. - 26-31p. Augusta J. A rapid evaluation plate-test for the biodegrability of plastics / J Augusta, H Widdecke // Appl. Microbiology. Biotechnology., - 1993. - Vol.39. – 673-678p. Marchessault R.H. Chemical, enzymatic and microbial degradation of bacterial and synthetic poly-R-hydroxyalkanoates / R.H Marchessault et al // Polym. Degrad. Stab., - 1994. - Vol.45. - 187-196p. Jendrossec D. Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids / D. Jendrossec, A. Schirmer, H.G. Schlegel // Appl. Microbiology. Biotechnology., - 1996. - Vol.46. - 451-463p. Mergeart J. Biodiversity of microorganisms that degrade bacterial and synthetic polyesters / J Mergeart, J Swings // Microbiology., - 1996. - Vol. 17. - 463-469 p. Волова Т.Г. Физико-Химические свойства полигдироксиалканоатов различного химического строения. / Т. Г. Волова и др. // Высокомолекулярные соединения, Серия А, - 2013.- том 55.- № 7 - 775–786с. Steinbu¨chel A. Fuchtenbusch, B. Bacterial and other biological systems for polyester production. Trends Biotechnology. -1998 -V.16- 419-427C. Doi Y. Microbial polyesters; VCH: New York, 1990. Noisshiki Y, Komatsuzaki S. Medical materials for soft tissue use // Japanese Patent Application. № JP 7275344 A2. - 1995. Kimura H. Hydrogen sulfide: its production, release and functions //Amino acids. – 2011. – . 41. – №. 1. – . 113-121 P. Lindenkamp N, Schürmann M. Steinbüchel A. A propionate CoAtransferase of Ralstonia eutropha H16 with broad substrate specificity catalyzing the CoA thioester formation of various carboxylic acids //Applied microbiology and biotechnology. – 2013. –Vol.97. – . 7699-7709 P. Steinbüchel A, Lütke-Eversloh T. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms //Biochemical Engineering Journal. – 2003. – Vol.16. – . 81-96p. Chou Y. J. Schlegelella aquatica sp. nov., a novel thermophilic bacterium isolated from a hot spring //International journal of systematic and evolutionary microbiology. – 2006. – Vol.56. – . 2793-2797p. Elbanna K. Studies on the biodegradability of polythioester copolymers and homopolymers by polyhydroxyalkanoate (PHA)-degrading bacteria and PHA depolymerases //Archives of microbiology. – 2004. – Vol.182. –. 212-225p. Пономарева, В.Т. Использование пластмассовых отходов за рубежом/ В.Т. Пономарева и др // Пластические массы, - 2002. -№5. - 44-48 С. Вторичные ресурсы: проблемы, перспективы, технология, экономика: Учебник, пособие/ Г.К.Лобачев, В.Ф.Желтобрюхов и др. – Волгоград, - 1999. – 180 С. Вторичные использование полимерных материалов / Под редак. Е.Г Любешкиной. – М., 1985. -192 С. Одесс В.И. Вторичные ресурсы: хозяйственный механизм использования / В.И. Одесс. – М., - 1988. – 15 С. Васнев В.А. Биоразлагаемые полимеры. Высокомолекулярные соединения. Сер. Б. – М., - 1997.- Т.39. - 2073-2086 С. Утилизация и вторичная переработка полимерных материалов: Учебник, пособие / А.С. Клинков и др. – Тамбов: ТГТУ, - 2005. – 80 С. Khanna S. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates / S Khanna, K Ashok // Process Biochemistry, - 2004. - Vol.40. - 607-619 P. Lütke-Eversloh T. et al. Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli //Nature materials. – 2002. – Vol.1. – . 236-240p. Lütke-Eversloh T. et al. Identification of a new class of biopolymer: bacterial synthesis of a sulfur-containing polymer with thioester linkages //Microbiology. – 2001. – Vol.147. – . 11-19p. Qi Q et al. Synthesis of poly (3hydroxyalkanoates) in Escherichia coli expressing the PHA synthase gene phaC2 from Pseudomonas aeruginosa: comparison of PhaC1 and PhaC2 //FEMS microbiology letters. – 1997. – Vol.157. – . 155-162p. Lütke-Eversloh T. Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate-co-3mercaptobutyrate) as a sulfur analogue to poly (3-hydroxybutyrate)(PHB) //Biomacromolecules. – 2001. –Vol.2. – . 1061-1065p. Volova T.G. Microbial polyhydroxyalkanoates - plastic materials of the 21st century (biosynthesis, properties, applications) / T.G Volova // Nova Science Pub. Inc., 2004. – 283p. Khanna S. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates / S. Khanna, K. Ashok // Proc. Biochem., 2004. – 607 – 619c. Sudesh K. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters / K Sudesh et al // Prog. Polym. Sci. - 2000. -.1503-1555p. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты (ПОА) – биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г Волова, В.И Севастьянов, и др.- Новосибирск.: СО РАН, - . 2003. – 330c. Lee S.Y, Choi J. Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoates production by bacterial fermentation. Applied Microbiology Biotechnology, 1999. -. 13–21p. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты (ПОА) – биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова и др ; под редак. В.И. Шумакова.- Красноярск: Платина, 2006. – 287с. Fernandez-Urrusuno, R. Development of controlled release formulations of alachlor in ethylcellulose / R Fernandez-Urrusuno, J. M Gines, et al // Journal of Microencapsulation – 2000. – Vol.17. – 331-342 Р. Komives C. Degradation of pesticides in a continuous-flow two phase microemulsion reactor / C Komives et al // Biotechnology Prog., - 1994. – Vol.10(3). – 340-343 Р. Sudesh K. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters / K Sudesh et al // Prog. Polym. Sci., - 2000. – Vol.25. – 1503–1555 Р. Dawes E.A. Novel biodegradable microbial polymers. Kluwer Academic, Dordrecht / E.A Dawes. - Netherlands, - 1990.- 287 p. Lee E. Y; Kang S. H et al. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate co-3-hydroxyvalerate) by newly isolated Agrobacterium sp. SH-1 and GW-04 from structurally unrelated single carbon substrates. J. Ferment. Bioeng. - 1995,-Vol.79. - 328-334 p. Doi Y.; Kunioka M et al. Nuclear magnetic resonance studies on poly(â-hydroxybutyrate) and a copolyester of â-hydroxybutyrate and â-hydroxyvalerate isolated from Alcaligenes eutrophus H16. Macromolecules - 1986, - Vol.19., - 2860-2864 Р. Yim K. S et al. Synthesis of poly(3hydroxybutyrate-co 3-hydroxyvalerate) by recombinant Escherichia coli. Biotechnology. Bioeng. - 1996, - Vol.49., - 495-503 Р. Shang L.; Do J. H et al. Optimization of propionic acid feeding for production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3 hydroxyvalerate) in fed-batch of Ralstonia eutropha. Chin. J. Chem. Eng. - 2003, - Vol.11, - 220-223 p. Du G. C et al. Feeding strategy of propionic acid for production of poly(3-hydroxybutyrate-co3-hydroxyvalerate) with Ralstonia eutropha. Biochem. Eng. J. – 2001. –Vol.8 – 103-110 Р. Green Ph.R. Formation of short chain|medium chain lehgth polyhydroxyalkanoate cjpolymers by fatty acid β-oxidation inhibited Ralstonia eutropha / Ph. R Green et al // Biomacromol., - 2002. – Vol.3. – 208-213 Р. Witholt B., Kessler B. Perspectives of medium chain length poly(hydroxyalkanoates), a versatile set of bacterial bioplastics // Curr. Opin. Biotechnology, - 1999. – Vol.10. – 279–285 Р. Hazer B., Steinbüchel A. Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medical applications // Appl. Microbiology. Biotechnology, - 2007. – Vol.74. – 1-12 p. Tao H.J et al. Spectroscopic analysis of chain conformation distribution in a biodegradable polyester elastomer, poly(beta-hydroxyoctanoate) // Macromolecules, - 1995. – Vol.28. – 2016–2022 p. Liu W.K., Chen G.Q. Production and characterization of mediumchain-length polyhydroxyalkanoate with high 3-hydroxytetradecanoate monomer content by fadB and fadA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 // Appl. Microbiology. Biotechnology,- 2007. – Vol.76. – 1153–1159 p. Kessler B., Witholt B. Factors involved in the regulatory network of polyhydroxyalkanoate metabolism // Biotechnology, - 2001. – Vol.86. – 97–104 p. Timm A., Steinbüchel A. Formation of polyesters consisting of medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids from gluconate by Pseudomonas aeruginosa and other fluorescent pseudomonads // Appl. Environ. Microbiology., - 1990. – Vol.56. – 3360–3367 p. Langenbach S. Functional expression of the PHA synthase gene phaC1 from Pseudomonas aeruginosa in Escherichia coli results in poly(3hydroxyalkanoate) synthesis / S Langenbach, B.H Rehm, A Steinbuchel // FEMS Microbiology. Lett., - 1997. – Vol.150. – 303-309 p. Ren Q, Fab G. An NADPH-dependent 3-ketoacyl reductase of Pseudomonas aeruginosa, provides precursors for medium-chain-length poly-3hydroxyalkanoate biosynthesis in Escherichia coli / Q. Ren, et al // Bacteriology, - 2000. – Vol.182. – 2978-2981 p. Park S.J. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates rich in specific monomers / S.J Park et al // FEMS Microbiology. Lett., - 2002. – Vol.214. – 217-222 p. Diniz S.C et al. High-celldensity cultivation of Pseudomonas putida IPT 046 and medium-chain-length polyhydroxyalkanoate production from sugarcane carbohydrates // Appl. Biochem. Biotechnology, - 2004. – Vol.119. – 51–69 p. Hartmann R, Hany R, Pletscher E, Ritter A, et al. Tailor-made olefinic medium-chain-length poly[(R)-3-hydroxyalkanoates] by Pseudomonas putida GPo1: Batch versus chemostat production // Biotechnology. Bioeng., - 2006. – Vol. 93. – 737–746 p. Huijberts G.N.M., Eggink G. Production of poly(3hydroxyalkanoates) by Pseudomonas putida KT2442 in continuous cultures // Appl. Microbiology. Biotechnology., - 1996. – Vol. 46. – 233–239 p. Kim D.Y et al. Biosynthesis, modification, and biodegradation of bacterial medium-chain-length polyhydroxyalkanoates // J. Microbiology, - 2007. – Vol.45. – 87–97p. van Beilen J.B., Panke S et al. Analysis of Pseudomonas putida alkanedegradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes // Microbiology, - 2001. – Vol.147. – 1621–1630p. Jung K., Hazenberg W et al. Two-stage continuous process development for the production of medium-chain-length poly(3hydroxyalkanoates) // Biotechnology. Bioeng., - 2001. – Vol.72. – 19–24p. Kim B.S. Production of poly (3-hydroxybutyric-co-3-hydroxyvaleric acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with substrate control using online glucose analyzer / B.S Kim, S.C Lee, S.Y Lee, et al// Enzyme. Microbiology. Technology., - 1994. – Vol.16. – 556-561p. Gumel A.M .Biosynthesis and Characterization of Polyhydroxyalkanoates Copolymers Produced by Pseudomonas putida Bet001 Isolated from Palm Oil Mill Effluent// A.M Gumel et al // PLoS One. - 2012. – 210-214p. Riedel S.L .Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) by Ralstonia eutropha in high cell density palm oil fermentations/ S.L Riedel, J Bader, et al// Biotechnol Bioeng. - 2012. – 74–83 р. Saharan B. S. Biotechnological Production of Polyhydroxyalkanoates: A Review on Trends and Latest Developments/B.S. Saharan et al //Chinese Journal of Biology. -2014.- р. 18. Tan G.Y.A. Start a research on biopolymer polyhydroxyalkanoate (PHA) G.Y.A. Tan, C.L. Chen et al // A review. Polymers. - 2014.- 706–754 р. Shankar Aditi .Microbial production of polyhydroxyalkanoates (PHA) from novel sources/ Aditi Shankar, Shalet D’Souza, Manish Narvekar, et al//International Journal of Research in Biosciences. -2015.- Vol. 4 Issue 4.- 16-28p. Koller M .Microbial PHA Production from waste raw materials. Chen GQ (eds) Plastics from bacteria: Natural functions and applications/ M Koller, A Atlic, M Dias, A Reiterer, et al.// Microbial Microbiology monographs. Springer Verlag Berlin Heidelberg. -2010. - 85-119p. Kourmentza C .Recent advances and challenges towards sustainable polyhydroxyalkanoate (PHA) production/ C Kourmentza, J Plácido, N Venetsaneas, A Burniol-Figols, et al// Bioengineering. – 2017. – 55p. Collins A.E.M, Evaluation of a controlled release compact containing tetracycline hydrochloride bonded to tooth for the treatment of periodontal disease/ A.E.M Collins, P.H. Deasy, D. Mac Carthay, et al // Int J.Pharm. – 1989. - 103‒114p. Lee S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates / S.Y Lee // Biotechnol. Bioeng. 1996. - Vol.49. - 1-14p. Su L .Enzymatic polymerization of (R)-3-hydroxyalkanoates by a bacterial polymerase / L. Su , R.W. Lenz, Y. Takagi et al// Macromolecules. - 2000.- 229–31p. Rai R .Poly-3-hydroxyoctanoate P(3HO), a medium chain length polyhydroxyalkanoate homopolymer from pseudomonas mendocina/ R. Rai, D.M. Yunos, A.R. Boccaccini, J.C. Knowles, et al. //Biomacromolecules. - 2011.- 26–36 P. Du C. Polyhydroxyalkanoates production from low-cost sustainable raw materials/ C Du, J Sabirova, W Soetaert, et al, // Curr. Chem. Biology. - 2012. – 14–25p. Audic J.L, Chaufer B, Daufin G. Non-food applications of milk components and dairy co-products: a review / J.L. Audic, B. Chaufer, et al - Lait. - 2003. - 417‒438 P. Lee S.Y., Kim M.K., Kim G.J.. Biotechnol. Lett. . -1995. - 571-574 P. G.Q Chen, X.R Jiang, Y Guo. Synthetic biology of microbes synthesizing polyhydroxyalkanoates (PHA) //Synthetic and Systems Biotechnology. – 2016. – Vol.1. – 236-242 P. Madison L.L. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic/ L.L Madison, G.W Huisman // Microbiology Mol. Biology Rev. - 1999. – 21-53 P. Chen G.Q .A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- andmaterials industry / G.Q Chen //Chem. Soc. Rev. - 2009. – 2434-2446 P. Chen G.Q .Plastics completely synthesized by bacteria:polyhydroxyalkanoates/G.Q Chen // Plastics from Bacteria. Springer, Berlin, Heidelberg. - 2010. – 17-37 P. Mozejko-Ciesielska J, Bacterial polyhydroxyalkanoates: Still fabulous? /J Mozejko-Ciesielska, R. Kiewisz, //Microbiology. Res. – 2016. – 271-282 P. Kourmentza C .Recent advances and challenges towards sustainable polyhydroxyalkanoate (PHA) production/ C Kourmentza, J Plácido, N Venetsaneas, A Burniol-Figols, C Varrone et al// Bioengineering. – 2017. – 55P. Lee S.Y, Chang H.N.. J. Environ Polymer Degrad. – 1994.- 169‒176p. Liu S.J. Exploitation of butyrate kinase and phosphotransbutyrylase from Clostridium acetobutylicum for the in vitro biosynthesis of poly (hydroxyalkanoic acid) /S.J Liu, A SteinbuÈchel //Springer Verlag Berlin Heidelberg . Appl Microbiology Biotechnology . - 2000. - V. – 545-552 P. Klinke H.B. Characterization of degradation products from alkaline wet oxidation of wheat straw/ H.B Klinke, B.K Ahring // Bioresource Technology. – 2002. – 15-26 P. Poirier M.C. DNA adduct formation and tumorigenesis in miceduring the chronic administration of 4-aminobiphenyl at multiple dose levels/ M.C Poirier, N.F Fullerton, B.A Smith et al//Carcinogenesis. - 1995. – 2917-2921 P. Волова Т.Г. Синтез сополимеров 3-гидроксибутирата-со-4гидроксивалерата водородокисляющими бактериями/ Т.Г Волова, Н.О Жила, Г.С Калачева, и др // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. – 544-550 C. Volova T. G. Biosynthesis of multi-component polyhydroxyalkanoates by the bacterium Wautersia eutropha / T.G Volova, G.S Kalacheva et al//Macromol. Symposia. – 2008. – 1-7 P. Volova T.G. A glucose-utilizing strain, Сupriavidus eutrophus В-10646: growth kinetics, characterization and synthesis of multicomponent PHAs / T.G Volova, E.G Kiselev, O.N Vinogradova, et al// Plos One. – 2014. – Vol.9. – 1-15 P. Volova T. Cell growth and PHA accumulation from CO2 and H2 of a hydrogenoxidizing bacterium, Cupriavidus eutrophus В-10646/ T Volova, E Kiselev, E Shishatskaya, et al, //Bioresour. Technology. - 2013. – 215-222 P. Volova T.G. Synthesis of P(3HB-co-3HHx) copolymers containing high molar fraction of 3-hydroxyhexanoate monomer by Cupriavidus eutrophus B10646/ T.G Volova, D.A Syrvacheva, N.O Zhila, A.G Sukovatiy //J.Chem. Technology and biotechnology. – 2016. - 416‒425 P. Volova T.G. In Polyhydroxyalkanoates - Plastic Materials of the 21st Century: production, properties, application / T. G. Volova/ - NY.: Nova Science Pub. Inc. - 2004. Lageveen R.G, Huisman G.W et al. Formation of polyesters by Pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and composition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates // Appl. Environ. Microbiology, - 1988. – Vol.54. – 2924-2932 P. Elbahloul Y, Steinbüchel A. Large-scale production of poly(3hydroxyoctanoic acid) by Pseudomonas putida GPo1 and a simplified downstream process // Appl. Environ. Microbiology, - 2009. – Vol.75. – 643-651 P. Шлегель Г. Общая микробиология / Шлегель Г/ Мир.- М., - 1987.- 567 С. Қосымшалар Қосымша 1 Полигидроксиалканоат синтезінің биохимиялық жолы Қосымша 2 жүктеу/скачать 2,32 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|