КЛОНИРОВАНИЕ кДНК ГЕНА ПОЛИ(АДФ-РИБОЗА) ПОЛИМЕРАЗЫ 2 ARABIDOPSIS THALIANA В E. CОLI И ХАРАКТЕРИСТИКААВТО-ПОЛИ(АДФ- РИБОЗИЛ)ИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Қуанбай Ə.Қ., Алияскарова У.С., Рахматуллаева Г.Т., Тайпақова С.М.
НИИ проблем биологии и биотехнологии
Казахский Национальный университет имени аль-Фараби
kuanbai.aigerim93@gmail.com
Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) катализирует синтез полимеров АДФ-рибозы
ковалентно-прикрепленные к акцепторным белкам. При этом донором остатков АДФ-рибозы
выступает НАД
+
. PARP белки могут оказывать значительное влияние на различные клеточные
процессы, такие как транскрипция, деление клеток, репарация ДНК и целостность теломеров.
Геном Arabidopsis thaliana, широко используемого модельного растительного организма,
кодирует по меньшей мере три предполагаемых PARP фермента: АtPARP1, AtPARP2 и AtPARP3.
Высокая степень консервативности на уровне аминокислотной последовательности между
ферментами арабидопсиса и млекопитающих позволяет предположить, что в растениях PARP
выполняет аналогичные функции как в животных системах. В отличие от млекопитающих,
значительно мало известно о поли-АДФ-рибозилировании в растениях. Практически не известно о
акцепторных белках поли-ADP-рибозы и белках, взаимодействующих с ADP-рибозой. В растениях не
обнаружены PARилированные белки, кроме гистонов и PARP. Идентификация новых акцепторных
белков поможет понять регуляторную функцию PARилирования в развитии растений и стрессовых
реакциях.
Нами был выделен кДНК ген atparp2 с применением реакции обратной транскрипции и
полимеразной цепной реакции. Осуществлена функциональная экспрессия atPARP2 гистидиновым
концом в E. cоli и очищена никель аффинной хроматографией до гомогенного состояния.
С помощью MALDI-TОF масс-спектрометрии установлено принадлежность рекомбинантного
белка к семейству поли(АДФ-рибоза)-полимераз. Выявлен, что продуктом экспрессии гена является
глобулярный белок массой 72,2 кДа, состоящий из 637 аминокислот (pI5,92). С применением
очищенных рекомбинантных белков atPARP2 были получены поликлональные антитела анти-
atPARP2.
Автомодифицирующию
активность
atPARP2
определяли
с
использованием
олигонуклеотидного дуплекса, содержащий разрыв цепи для активации процесса поли-АДФ-
рибозилирования в присутствии НАД. В результате анализа продуктов реакции методом Вестерн-
блоттинга с анти-PAR антителами мы показали что аtPARP2 в присутствии активирующей ДНК
может катализировать реакцию авто-поли-АДФ-рибозилирования путем многократного переноса
ADP-рибозных групп из NAD+ на себя.
В присутствие ингибитора PARP 3-AB АДФ-рибозилирование аtPARP2 значительно
блокируется. Необходимо отметить, хроматографически очищенный аtPARP2 частично АДФ-
рибозилирован как в присутствии, так и в отсутствии активирующей ДНК и 3-AB, так как
распознается анти-PAR антителами.
158
Можно
предположить,
что
очищенные
аtPARP2
авто-АДФ-рибозилированы
до
хроматографической очистки, т.е. во время экспрессии в E. cоli. Научный руководитель: д.б.н., профессор, академик НАН РК Бисенбаев А.К.