ЛИТЕРАТУРА
1.
Sharifzaden А., Doosti A. Study of Lactoferrin Gene Polymorphism in Iranian Holstein Cattle Using
PCR-RFLP Technique (2011). Global Veterinaria. 6 (6): 530-536.
2.
Schwerin M., Toldo S.S., Eggen A., Brunner R.M., SeyfertH.M., Fries R. (1994): The bovine lactoferrin
gene(LTF) maps to chromosome 22 and syntenic groupU12. Mammalin Genome, 5, 486–489.
3.
BarzegariA, AtashpazS, GhabiliK, NematiZ, etal. (2010). PolymorphismsinGDF9 andBMP15
associated with fertility and ovulation rate in Moghani and Ghezel sheep in Iran. Reprod. Domest. Anim.
45: 666-669.
4.
Tang K.Q., Yang W.C., Li S.J. and Yang L.G. (2013) Polymorphisms of the bovine growth
differentiation factor 9 gene associated with superovulation performance in Chinese Holstein cows.
Genetics and Molecular Research 12 (1): 390-399
5.
Wang TT, Wu YT, Dong MY, Sheng JZ, et al. (2010). G546A polymorphism of growth differentiation
factor-9 contributes to the poor outcome of ovarian stimulation in women with diminished ovarian
reserve. Fertil. Steril. 94: 2490-2492.
173
LTF ЖӘНЕ GDF 9 ГЕНДЕРІ БОЙЫНША ГОЛШТЕИН ТҰҚЫМДАС СИЫРЛАРДА ДНҚ
ПОЛИМОРФИЗМІН ПТР-РФҰП ТАЛДАУЫМЕН ЗЕРТТЕУ
Е.С. Усенбеков
«Байсерке-Агро» ЖШС қарасты голштеин тұқымдас сиырларына 115 бас лактоферрин
және өсу факторының диффеенциясы(GDF9) гендері бойынша генотиптеу жүргізілген,
лактоферрин генінің генетикалық варианттары мен жасырын желінсаумен ауыру арасында
байланыс анықталған.
STUDY LTF AND GDF 9 GENE POLYMORPHISMS IN HOLSTEIN
COWS BY PCR-RFLP ANALYSIS
Y.S. Ussenbekov
Work on genotyping of breeding cows LLP "Bayserke-Agro" in the amount of 115 goals for the
loci lactoferrin gene and differentiation of growth factor (GDF9), a correlation between the genetic
variants LTF gene and the incidence of subclinical mastitis.
УДК: 616.151.5-07
Е.С. Усенбеков,
1
С.Н. Прошин
2
1
НАО Казахский национальный аграрный университет г. Алматы
2
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
г Санкт-Петербург
ДИАГНОСТИКА ИНСЕРЦИИ НУКЛЕОТИДОВ В КОДИРУЮЩЕЙ ЧАСТИ ГЕНА
FXID У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ АМПЛИФИКАЦИИ
Аннотация. В педиатрической клинике проблематично провести рандомизированное
исследование из-за сложности выявления таких детей-носителей по наследственной аномалии по
определенному фактору свертывания крови. В связи с этим модель дефицита XI фактора
свертывания крови у млекопитающих (Bos Taurus L.) с наследованием по аутосомально-
рецессивному типу представляется особенно перспективной. По результатам генетического
мониторинга у племенных быков-производителей и коров носителей генетического дефекта,
дефицита XI фактора свертывания крови не выявлены.
Ключевые слова: дефицит XI фактора свертывания крови, аутосомно-рецессивная болезнь,
инсерция, репродуктивная функция млекопитающих.
Незначительные кровотечения довольно часто встречаются у детей и в некоторых случаях
маскируют серьезные заболевания системы свертывания крови. Как правило, это редкие
наследственные заболевания, связанные с недостаточностью таких факторов свертывания как I, II, V,
VII, X, XI и XIII, а также дефицит, наиболее часто сопряженный с совместной недостаточностью
факторов V и VIII и факторов, синтез которых связан с витамином К [2]. Считается, что у детей
кровотечения из носа и легкие кровотечения являются нормой в 39 и 24 % случаев [6]. К другим
кровотечениям, которые, как считается, не связаны с дефицитом факторов (наследственных)
свертывания, относятся определенные анатомические аномалии недоразвития черепно-мозговой,
желудочно-кишечной, мочеполовой систем и, что особенно актуально, системы эндокринной
регуляции: тяжело протекающие и затяжные менструации у девочек-подростков, сопряженные,
предположительно, с недоразвитием гипоталамо-гипофизарно-гонадного тракта, включая
ановуляторные циклы [1].
Дети со скрытыми кровотечениями, сопряженными с врожденными аномалиями факторов
свертывания крови, часто невосприимчивы к стандартным методам антикоагуляционной
фармакотерапии. При этом в педиатрической клинике зачастую трудно провести рандомизированное
Введениеледование, вследствие сложности выявления таких детей-носителей наследственной
аномалии по определенному фактору свертывания крови [2]. Поэтому мы и предприняли данное
сравнительное экспериментальное исследование. По сведениям OMIA — ON LINE MENDELIAN
INHERITANCE IN ANIMALS каталога у млекопитающих (Bos Taurus L.) в настоящее время
выявлено 462 генетически обусловленных морфологических и функциональных нарушений и из них
46 наследственных аномалий можно идентифицировать с помощью молекулярно-генетических
174
методов. Своевременная диагностика данных мутаций и выбраковка животных и племенного
материала, а также требования генетического паспорта при закупке животных, эмбрионов,
замороженной спермы позволяют элиминировать наследственные заболевания.
Дефицит XI фактора свертывания крови у Bos Taurus L. является аутосомальным
рецессивным наследственным генетическим дефектом. Впервые данная патология была
зарегистрирована у Bos Taurus L. в 1969 году. Часто этиологическим фактором большинства скрытых
генетических дефектов у животных являются точечные мутации в кодирующей части
соответствующих генов. Известно, что генетический дефект, дефицит XI фактора свертывания крови
у Bos Taurus L. (FXID), наоборот, является последствием вставки нуклеотидной последовательности в
составе экзона 12 гена FXI длиной 76 пар оснований. В результате инсерции появился STOP codon
(TAA) [3].
Высокая скорость распространения вредных мутаций определяется рецессивным характером
их наследования. Продукты таких генов, как правило, участвуют в регуляции тканеспецифичных
функций и неблагоприятные эффекты мутантного аллельного варианта компенсируются в
гетерозиготе нормальной функцией аллеля дикого типа. Селекция на уровне фенотипа является
неэффективной в связи с низкой частотой гетерозигот по отношению к гомозиготам. Фенотипически,
дефицит XI фактора (FXID) свертывания крови у телят характеризуется длительным кровотечением
из пупочного канатика, анемией. У коров, гетерозиготных носителей дефиита XI фактора
свертывания крови, проявляется молозиво розового цвета, обычно такие животные воспримчивы к
пневмонии, маститам и воспалениям верхнего репродуктивного тракта [4]. Исследованиями наших
зарубежных коллег установлено, что недостаточность FXI фактора свертывания крови у
млекопитающих негативно влияет на репродуктивную функцию у коров, в частности у таких
животных снижается рост фолликулов и половой цикл сопровождается снижением пиковой
концентрации эстрадиола в крови животных. У Bos Taurus L., гомозиготных и гетерозиготных
носителей генетического дефекта фактора XI свертывания крови регистрируются низкие показатели
воспроизводительной функции, часто встречаются трудные отелы и рождение нежизнеспособных
телят [5].
В
настоящее
время
молекулярно-генетические
основы
генетических
дефектов
млекопитающих, принадлежащих к виду Bos Taurus L., достаточно хорошо изучены, на основании
этих исследований разработаны методы диагностики наследственных заболеваний. Все
наследственные заболевания животных в той или иной степени связаны с нарушением
репродуктивной функции у коров, снижением резистентности организма телят, у носителей мутации
генетического дефекта часто регистрируются эмбриональная смертность, повышение индекса
осеменения в результате ранней смертности доимплантационных эмбрионов в период стельности [6].
Цель работы - разработка метода идентификации дефицита XI фактора свертывания крови
методом полимеразной цепной реакции и изучение распространенности данной патологии у
популяции Bos Taurus L. Акмолинской и Алматинской областей.
Материалы и методы исследования. Исследования проводились на 35 племенных быках АО
«Асыл-Тулик» и на 24 быках ТОО «Асыл» и 37 коровах голштинской породы ТОО «Байсерке-Агро»
в рамках реализации проекта «Мониторинг племенных животных Республики Казахстан на
носительство генетических дефектов с помощью молекулярно-генетических методов» в учебно-
научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра Казахского
национального аграрного университета. В качестве материала для исследования были использованы
замороженная сперма быков и периферическая кровь коров. ДНК из крови коров и спермы быков
выделяли с помощью набора «ДНК сорб В».
При выделении ДНК из замороженной спермы с целью оптимизации и выделения более
качественной ДНК нами был использован способ предварительной обработки спермы следующим
образом: вносили в пробирку 200 мкл спермы, затем добавляли1 мл лизирующего буфера, имеющий
состав: 100 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCI, рН 8,0 и перемешивали в течение 30 секунд, далее
центрифугировали g 10 000 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования, суспендировали
осадок в 500 мкл буфера: 100 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCI, рН 8,0 и добавляли 8 мкл
2
‑меркаптоэтанола. Затем перемешивали на вортексе в течение 1 минуты и оставляли на 30 минут
при комнатной температуре. Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере «Терцик»
производства России. Для детекции носителей дефицита XI фактора свертывания крови использовали
праймеры: F
‑5′-CCCACTGGCTAGGAATCATT-3′ и R‑5′- CAAGGCAATGTCATATCCAC-3′.
Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать фрагмент гена FXID размером
175
244 п.н. у здоровых гомозиготных животных, 244 п.н. и 320 п.н. у гетерозиготных носителей и 320
п.н. у гомозиготных носителей генетического дефекта (рис. 1).
Рисунок 1. Электрофореграмма продукта амплификации участка гена FXI.
Условия проведения ПЦР: первый шаг - денатурация ДНК при температуре 95 °C - 10 минут,
второй шаг 35 циклов, денатурация при 95 °C - 30 сек, отжиг праймеров - 55 °C 60 с и элонгация при
температуре 72 °C 30 с. Завершающий синтез при 72 °C продолжительностью 10 мин. Хранение при
+4 °C. Объем реакционной смеси был 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 Х буфера для
ПЦР, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации
каждого dNTP, 0,5 мкл фермента Taq Polymerase с активностью 5u/μl, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл
дистиллированной воды.
Результаты исследования и их обсуждение. В нашей работе для выделения ДНК из спермы
быков
‑производителей и из периферической крови коров был использован метод экстракции ДНК с
помощью набора «ДНК сорб В». Амплификация нужного фрагмента гена FXID проводилась с
использованием прямого и обратного праймеров в течение 35 циклов. ПЦР-диагностика данного
генетического дефекта основана на том, что у здоровых гомозиготных животных при амплификации
образуется один бэнд размером 244 п.н., в случае гетерозиготного носительства в результате
инсерции (вставки нуклеотидных последовательностей 76 п.н.) образуется второй бэнд размером 320
п.н.
Нами были тестированы методом полимеразной цепной реакции 59 голов племенных
быков
‑производителей и 37 голов коров голштинской породы Канадского происхождения ТОО
«Байсерке-Агро». На электрофореграмме хорошо видны полоски ДНК-размером 244 п.н., лунки (1-
13) и лунка М - ДНК-маркер плазмида pUC19DNA (рис. 1), рестрицированная эндонуклеазой MspI.
Данный ДНК-маркер имеет фрагменты длиной 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34, 34 и
на электрофореграмме четко видно, что амплификат размером 244 п.н. идет на уровне 242 п.н. ДНК-
маркера. Предварительные результаты исследований свидетельствуют, что среди исследуемых
животных отсутствуют носители генетического дефекта - дефицита XI фактора свертывания крови
крупного рогатого скота (FXID). При этом в последнее время Республика Казахстан ежегодно в
большом объеме закупает живой племенной скот и замороженную сперму племеных
быков
‑производителей зарубежной селекции.
В последнее время племенные агроформирования Республики Казахстан ежегодно в большом
объеме закупают живой племенной скот и замороженную сперму племеных быков-производителей
зарубежной селекции. В связи с вышеизложенным, считаем необходимым проведение мониторинга
всего племенного поголовья на носительство данного наследственного заболевания, так как у
гетерозиготных носителей дефицита XI фактора свертывания не проявляются клинические признаки
этого генетического дефекта. Использование метода полимеразной цепной реакции позволяет
выявить гомозиготных и гетерозиготных носителей генетического дефекта, дефицита XI фактора
свертывания крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Appelbaum H., Acharya S. S. (2011) Heavy menstrual bleeding in adolescents: hormonal or he
hematologic? Minerva Ginecology. 63 (6): 547–561.
2. Peyvandi F., Palla R., Menegatti M. (2012) European Network of Rare Bleeding Disorders Group.
Coagulation factor activity and clinical bleeding severity in rare bleeding disorders: results from the
European Network of Rare Bleeding Disorders. J Thromb Haemost. 10 (4): 615–621.
3. Brown D. L. (2005) Congenital bleeding disorders. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 35
(2): 38–62.
176
4. Kunieda M., Tsuji T., Abbasi A. R., Khalaj M., Ikeda M., Miyadera K., Ogawa H., Kunieda T.
(2005) An insertion mutation of the bovine F11 gene is responsible for factor XI deficiency in Japanese
black cattle. Mamm. Genom. 16: 383–389.
5. Marron B. M., Robinson J. L., Gentry P. A., Beever J. E. (2004) Identification of a mutation
associated with factor XI deficiency in Holsteincattle. Anim Genet. 35 (6): 454–456.
6. Meydan H., Yildiz M. A., Özdil F., Gedik Y., Özbeyaz C. (2009) Identification of factor XI
deficiency inHolsteincattle in Turkey. Acta Vet. Scand. 22: 51–55.
ІРІ ҚАРА МАЛЫНЫҢ FXID ГЕНІНІҢ ҚҰРАМЫНДАҒЫ НУКЛЕОТИДТЕР
ИНСЕРЦИЯСЫН АМПЛИФИКАЦИЯЛАУ ӘДІСІМЕН БАЛАУ
Е.С. Усенбеков, С.Н. Прошин
Педиатриялық практикада рандомизировандық зерттеулер жүргізумен белгілі бір қан ұю
факторының кемтарлығы бар тасымалдаушы балаларды анықтау қиындығы бар. Сондықтан,
қан ұюдың XI факторының дефицитін сүт қоректілерде (Bos Taurus L.) модель ретінде
зерттеу тиімді және осы аурудың аутосомальдық-рецессивтік жолмен таралуын зерттеу
қолайлы әдіс болып табылады. Генетикалық мониторинг жасау нәтижесінде асыл тұқымды
бұқалар мен сиырларда қан ұюдың XI факторының жетіспеушілігі, генетикалық
кемтарлығының тасымалдаушылары табылмады.
DIAGNOSIS INSERTION OF NUCLEOTIDES IN THE GENE CODING PART FOR FXID
CATTLE AMPLIFICATION METHODS
Y.S. Ussenbekov, S.N. Proshin
The pediatric clinic is problematic to conduct a randomized trial because of the difficulty of
identifying such child carriers for genetic abnormalities on a specific blood clotting factor. In connection
with this model XI deficiency of blood coagulation factor in a mammal (Bos Taurus L.) with inheritance
for autosomal recessive manner it is especially promising. According to the results of genetic monitoring
in breeding bulls and cows carriers of the genetic defect, deficiency XI coagulation factor not identified.
УДК: 581.91
А.П.Цыганов
Восточно-Казахстанский государственный университет имени Сарсена Аманжолова
города Усть-Каменогорск
РАСТИТЕЛЬНОСТЬ «КАРАОТКЕЛЬ»
Аннотация: В статье приведены результаты флористических и геоботанических
исследований. Определен видовой состав высших сосудистых растений. Выявлены особенности
эколого-географического и зонального распределения растений. Составлены ценотические
характеристики.
Ключевые слова: растительность, флора, ценоз, природный комплекс, ландшафт.
Исследуемая территория «Караоткель» определена как флористический выдел или
конкретная флора [6] для выявления наиболее характерных особенностей формирования видового
состава растительного покрова, в условиях неоднородности сложения почв и растительных ценозов,
представленных в естественных границах пересечения крупных геоморфологических природных
комплексов. В административном плане территория находится в Кокпектинском районе Восточно –
Казахстанской области, площадью около 270 км
2
. Населенные пункты : село Ульгулималши, по всей
территории размещены зимовки фермы. Физико – географические границы определены
промежуточным положением и пограничной близостью Калбы или Калбинского Алтая, песчаным
массивом Кызылкум в дельте р. Буконь, береговой линией Бухтарминского водохранилища,
Зайсанской котловиной и на западе и юго-западе Кокпектино – Чарским мелкосопочником.
В
ландшафтном
отношении
территория
представлена
плоскими
аллювиально-
пролювиальными и аллювиальными равнинами континентальных дельт, образованными в следствии
аккумуляции предустьевой части рек Буконь и Кулуджун. Равнины сформированы в результате
177
древних аккумуляций рыхлых масс полеоген-неогенового возраста. Это обычно увалистые
слабоволнистые поверхности на светло-каштановых карбонатных почвах с уклонами 4-7
0
и
относительными повышениями 20-30 м, где отмечается присутствие песчаных холмисто-грядовых и
бугристых массивов. Рассматривая структурно территорию как природно-территориальный
комплекс в основу описания растительности были положены морфоструктурные, биоклиматические,
биоценотические признаки, геоботанические и флористические исследования[1].
Климат – резкоконтинентальный аридно – гумидного типа. Он определяет условия
распространения умеренно - засушливых комплексов среднеазиатских пустынь северного типа, с
развитием сухо-стенных, полупустынных и пустынных ландшафтов. Почвы в целом бурые степные
и пустынные, реже серо-бурые. Отдельные участки территории представленны фрагментами
песчанных пустынь и солончаков. Понижения поймы объединяют лугово – черноземные и лугово –
каштановые почвы[2].
Флора «Караоткель» насчитывает 114 видов из 91 рода и 37 семейств.
Согласно
растительно-ценотических составляющих, при классификации элементов
растительности использованы принципы А.А. Соколова [4] и А.П. Цыганова [5].
На выделенной территории, имеют место в распространении, сообщества растений зональной
растительности пустынно-остепененного пояса пустынной растительной зоны и предгорный
пустынно-степной пояс растительной зоны пустынно-степной, а также просматриваются элементы
интрозональной растительности.
Пустынная растительная зона представлена пустынно-остепененным поясом, объединяющим
территории, с выраженными, на основе доминирования в зональном растительном покрове,
типичными растительными ценозами остепененных и типичных (настоящих) пустынь.
В остепененных пустынях господствуют полынно-злаковые, полынно-терескеновые
растительные сообщества с малым участием злаков. Локально и в меньшей степени представлены
полынно-галофитные растительные ценозы.
Сомкнутость пустынной растительности не превышает 20-30%. В растительных зонах и
поясах наблюдаются фрагменты интрозональной растительности. Эта растительность в своем
распространении также зональна, но видоизменяется в зависимости от условий произрастания
растений. На исследуемой территории «Караоткель» имеют место растительные ценозы
интрозональной растительности которые развиваются в депрессиях рельефа, суходольных ложбинах,
слабо выраженных понижениях, а также на границах контуров Бухтарминского водохранилища, рек,
населенных пунктов, болот и солончаков. Северо-восточная часть в границах по береговой линии рек
Буконь и Кулуджуна, примыкает к территории Кулуджунского государственного зоологического
заказника, представленной элементами песчаного типа пустынь, пустынной растительной зоны.
Пустынно-степная зона с пустынно-степным поясом характеризуется заметным участием в
составе растительных ценозов ксерофильных доминирующих дерновинных злаков, пустынных
ксерофильных полукустарничков и немногочисленных кустарников и кустарничков. Растительные
ценозы представлены: типчаково-ковыльными, ковыльными, чиевыми, вейниковыми, вейниково-
злаковыми,
вейниково-солодковыми,
солодковыми,
солодково-софоровыми,
софорово-
разнотравными, вейниково-софорово-кермековыми сообществами.
Среди растительных ценозов ксерофильных полукустарников выделяются полынно-чиевые,
полынно-злаково-чиевые сообщества. Сомкнутость растительности иногда достигает 80-90%.
Кустарниковые
ксерофильные
и
кустарниково-полукустарниково-разнотравные
ценозы
характеризуются обьединениями: чингилово-полынные, чингилово-полынно-злаковые, чингилово-
софоровые, тавологовые, тавологово-карагановые. На границах распространения равнинных
пустынно-степных растительных ценозов на светло-каштановых карбонатных почвах, в районе
дельты р. Буконь отмечаются растительные ценозы на песках. Это полынно-колосняковые,
колосняково-софоровые, колосняково-тавологовые.
Сомкнутость растительности не превышает 30-40%. Иногда на песчаных субстратах здесь
развиваются псамофильные пустынные степи с отдельными деревьями сосны обыкновенной.
Интрозональная растительность имеет распространение на субстратах, в условиях и
сообществах экологически специфичных местообитаний.
Среди них сухие ложбины, сформированные на глубоких грунтовых водах. Здесь
располагаются кустарниковые разнотравно-злаковые луга, ковыльно-разнотравные кустарниковые
лугостепи. Повсеместно наблюдаются контакты и совмещения представителей сообществ зональных
растительных поясов посредством участия в сложении растений интрозональной растительности.
178
В пустынно-степном и пустынном поясах территории «Караоткель» отмечаются
интрозональные элементы на слабовыраженных понижениях с среднеглубоким залеганием
грунтовых вод это полынно-ковыльно-типчаковые кустарниковые с отдельными влаголюбивыми
растениями-доминантами: чий блестящий, волоснец узкий, чингиль серебристый и другие. На
минерализованных грунтовых водах доминируют солонцовые лебедовые, полынные и кермековые
сообщества.
В депрессиях рельефа, на близких грунтовых водах распространены травяные и травяно-
кустарниковые, мелколиственные сообщества с доминантами: Ива козья, И. прутовидная, И.
белая, Тополь черный.
На пресных, местами жестких грунтовых водах сформированы мезофильные и
ксеромезофильные сообщества: разнотравно-вейниковые, разнотравно-пырейные, волоснецово-
чиевые.
На сильно минерализованных грунтовых водах типичны галофитно-злаковые сообщества,
солончаковые луга.
В депрессиях рельефа на очень близких грунтовых водах различной минерализации от кислой
до слабо минерализованной сред формируются заболоченные и низинно-болотные и пойменные
луга: осоковые, тростниковые, ситниковые сообщества. Иногда, в условиях на сильно
минерализованных водах встречаются солеросники.
На береговой линии в понижениях с почвенно-грунтовыми водами, у побережья
Бухтарминского водохранилища в избыточно обводненной дельте р. Буконь встречаются плавневые
заболоченные участки: тростниковые, ситниковые, рогозовые.
Растительные сообщества по морфологическим признакам и кормовой урожайности
разнообразны. Это объясняется неоднородностью в распространении почв, неравномерностью
распределения влаги, и как следствие, особенностями фенолого-таксономического характера в
формировании растительных сообществ различных участков исследуемой территории «Караоткель».
Достарыңызбен бөлісу: |