Химико биологическая серия 1 2014


Киян В. С., Сарбасов Д. Д.*, Берсимбаев Р. И



Pdf көрінісі
бет40/101
Дата06.01.2022
өлшемі1,29 Mb.
#14244
1   ...   36   37   38   39   40   41   42   43   ...   101
Байланысты:
chimbiol 1 2014 (3) СТР 49

Киян В. С., Сарбасов Д. Д.*, Берсимбаев Р. И.

РОЛЬ MTOR В ИМПОРТЕ РИБОСОМАЛЬНЫХ 

БЕЛКОВ

Для  доказательства  роли  mTOR  в  процессе  импорта 

рибосомальных белков в ядро клетки было проведено ряд экспериментов 

показывающих  влияние  ингибиторов  mTOR  киназы  на  импорт 

рибосомальных  белков.  Были  получены  линии  белков  мутантные 

по  сайтам  фосфорилирования.  Изучено  белковое  взаимодействие 

mTOR с главным транспортным белком Importin β1 и активатором 

рибосомального  импорта  RanBP2  путем  сайт-направленного 

мутагенеза.  Показан  механизм  регуляции  рибосомальных  белков 

путем фосфорилирования mTOR киназой белка RanBP2. 

mTOR (mammalian target of rapamycin) является мишенью молекулы 

называемой рапамицином, макролид которого продуцируется бактериями 

рода Streptomyces Hygroscopicus и впервые получил пристальное внимание 

из-за его широких антипролиферативных свойств. Серин/треонин киназа 



mTOR    привлекла  много  внимания  в  качестве  основного  регулятора 

наиболее фундаментальных биологических процессов, таких как рост и 

пролиферация клеток, апоптоз. Данная киназа работает в двух различных 

мультибелковых  комплексах  называемых  mTORC1,  содержащий  mTOR



RaptormLST8 и mTORC2 включающий mTORRictorSin1 и mLST8. Анализ 

всей клетки является ценным и незаменимым подходом для характеристики 

основной клеточной функции протеина. Тем не менее, локализация белка в 

конкретном внутриклеточном пространстве, а также анализ субклеточного 

перераспределения курсирующих белков может значительно улучшить наше 

понимание известных функций и указать на новые сигнальные процессы.  

В соответствии со своей ранней определенной роли в контроле трансляции, 

mTOR  первоначально  рассматривался  как  цитоплазматическая  киназа, 

работающая в эндомембранной области цитозола [1, 2]. Первые сообщения 

о  mTOR  субклеточном  распределении  выявили  ядерную  локализацию 

mTOR,  но  не  смогли  продемонстрировать  функциональную  значимость

В  то  время  как  ранее  было  показано,  что  mTOR  косвенно  вовлечен  в 

регуляцию транскрипции, контролируя транспорт из цитоплазмы в ядро 

транскрипционных  факторов,  недавние  исследования  показали  прямое 

взаимодействие mTOR с промоутерами различных генов, обеспечивающих 

функциональную значимость ядерной локализации mTOR [3 - 5]. 

Материалы и методика исследованийТрансфекцию клеточной линии 

293Т проводили на 6 см чашках в количестве 2×10

5

 на 1 мл питательной среды 



путем культивирования в течение 24 часов. Количество трансформированной 

ДНК составляло 0,5-1,0 мг на 1 чашку. При образовании комплексов ДНК и 

липофектамина-2000 использовали соотношение 1:3. Клетки выращивали 

в  течение  24-48  часов  при  37°С  и  5%  содержанием  СО

2

.  Электрофорез 



проводили в градиентном полиакриламидном геле по методу J. Laemmli et al

Для разделения образцов нами использовались коммерческие градиентные гели 

4-12% (фирма «BioRad», США). Перенос белков из электрофорезного геля на 

нитроцеллюлозную мембрану осуществляли по H. Towbin et al. Проявление 

изучаемых белков на мембране проводили с использованием специфических 

антител (фирма «Santa Cruz», США). Для лизирования клеток использовали 

буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl, pH7.5, 2.5 мМ MgCl

2

, 1.5 мМ KCl, 0.5% 



Тритон X-100, 0,2 М LiCl, 0.5% деоксихолата натрия (C

24

H



39

NaO


4

). Используемые 

нуклеотидные последовательности ДНК взятые из GenBank (

http://www.

 

ncbi.



nlm.nih.gov

), синтез которых проводили с использованием компании «Sigma», 

США. Обработку данных проводили с использованием программы «Serial 

Cloner». Мутирование проводили методом сайт-направленного мутагенеза 

с использованием коммерческих наборов Quik Change II XL Site-Directed 



Mutagenesis Kit («Agilent Technologies», США).

Результаты исследованийНа первом этапе нами проводилась работа по 

изучению белкового взаимодействия рекомбинантных форм mTOR и Importin 

β1.  Трансфекцию  клеток  проводили  с  использованием  рекомбинантных 

белков, у которых имелись специфические метки, позволяющие изолировать 

комплексы с данными белками: myc-mTORflag-Importin β1 и flag-Raptor. Белок 

flag-Raptor использовали в качестве положительного контроля, так как этот 

белок входит в состав mTORC1 и позволяет методом иммунопреципитации 

изолировать  изучаемый  белок  mTOR.  Реакцию  иммунопреципитации 

проводили с использованием специфических антител  flag (фирма «Santa 



Cruz», США). Полученные данные представлены на рисунке 1. 




Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   36   37   38   39   40   41   42   43   ...   101




©emirsaba.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет