Химико биологическая серия 1 2014
Киян В. С., Сарбасов Д. Д.*, Берсимбаев Р. И
жүктеу/скачать 1,29 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- », США)
| Киян В. С., Сарбасов Д. Д.*, Берсимбаев Р. И.
РОЛЬ MTOR В ИМПОРТЕ РИБОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ Для доказательства роли mTOR в процессе импорта рибосомальных белков в ядро клетки было проведено ряд экспериментов показывающих влияние ингибиторов mTOR киназы на импорт рибосомальных белков. Были получены линии белков мутантные по сайтам фосфорилирования. Изучено белковое взаимодействие mTOR с главным транспортным белком Importin β1 и активатором рибосомального импорта RanBP2 путем сайт-направленного мутагенеза. Показан механизм регуляции рибосомальных белков путем фосфорилирования mTOR киназой белка RanBP2. mTOR (mammalian target of rapamycin) является мишенью молекулы называемой рапамицином, макролид которого продуцируется бактериями рода Streptomyces Hygroscopicus и впервые получил пристальное внимание из-за его широких антипролиферативных свойств. Серин/треонин киназа mTOR привлекла много внимания в качестве основного регулятора наиболее фундаментальных биологических процессов, таких как рост и пролиферация клеток, апоптоз. Данная киназа работает в двух различных мультибелковых комплексах называемых mTORC1, содержащий mTOR, Raptor, mLST8 и mTORC2 включающий mTOR, Rictor, Sin1 и mLST8. Анализ всей клетки является ценным и незаменимым подходом для характеристики основной клеточной функции протеина. Тем не менее, локализация белка в конкретном внутриклеточном пространстве, а также анализ субклеточного перераспределения курсирующих белков может значительно улучшить наше понимание известных функций и указать на новые сигнальные процессы. В соответствии со своей ранней определенной роли в контроле трансляции,
работающая в эндомембранной области цитозола [1, 2]. Первые сообщения о mTOR субклеточном распределении выявили ядерную локализацию
В то время как ранее было показано, что mTOR косвенно вовлечен в регуляцию транскрипции, контролируя транспорт из цитоплазмы в ядро транскрипционных факторов, недавние исследования показали прямое взаимодействие mTOR с промоутерами различных генов, обеспечивающих функциональную значимость ядерной локализации mTOR [3 - 5]. Материалы и методика исследований. Трансфекцию клеточной линии
5 на 1 мл питательной среды путем культивирования в течение 24 часов. Количество трансформированной ДНК составляло 0,5-1,0 мг на 1 чашку. При образовании комплексов ДНК и липофектамина-2000 использовали соотношение 1:3. Клетки выращивали в течение 24-48 часов при 37°С и 5% содержанием СО 2 . Электрофорез проводили в градиентном полиакриламидном геле по методу J. Laemmli et al. Для разделения образцов нами использовались коммерческие градиентные гели 4-12% (фирма «BioRad», США). Перенос белков из электрофорезного геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли по H. Towbin et al. Проявление изучаемых белков на мембране проводили с использованием специфических антител (фирма «Santa Cruz», США). Для лизирования клеток использовали буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl, pH7.5, 2.5 мМ MgCl 2 , 1.5 мМ KCl, 0.5% Тритон X-100, 0,2 М LiCl, 0.5% деоксихолата натрия (C 24 H 39 NaO
4 ). Используемые нуклеотидные последовательности ДНК взятые из GenBank (
nlm.nih.gov ), синтез которых проводили с использованием компании «Sigma», США. Обработку данных проводили с использованием программы «Serial
с использованием коммерческих наборов Quik Change II XL Site-Directed Mutagenesis Kit («Agilent Technologies», США). Результаты исследований. На первом этапе нами проводилась работа по изучению белкового взаимодействия рекомбинантных форм mTOR и Importin
белков, у которых имелись специфические метки, позволяющие изолировать комплексы с данными белками: myc-mTOR, flag-Importin β1 и flag-Raptor. Белок
белок входит в состав mTORC1 и позволяет методом иммунопреципитации изолировать изучаемый белок mTOR. Реакцию иммунопреципитации проводили с использованием специфических антител flag (фирма «Santa Cruz», США). Полученные данные представлены на рисунке 1. |