Клетканың бөлшектерін фракциялау

11
1.1-кестеде егеуқұйрықтың бауыр клеткаларынан алынған мөлшері 
мен тығыздығы əртүрлі бөлшектер жəне олардан бөлінетін фрагмент-
тер келтірілген.
1.1-кесте
Егеуқұйрықтың бауыр клеткасының бөлшектері 
[А. Антонов, 1989] 
Фракциялар
Бөлшек-
тердің 
диаметрі, 
мкм
Тұнбаға түсу режимі 
осаждения
Тепе-тең 
тығыздығы 
г/см
жылдам-
дағы, g
уақыт, мин
Тұтас клеткалар
15-20
600
16
1,20
Ядролар
3-12
600
15
1,32
Гольджи аспабы 
(ірі бөлшектер)
3-12
600
15
1,32
(көпіршіктер)
1-3
2000
20
1,12-1,16
Митохондриялар
0,05-0,5
145000
15
1,06-1,14
Лизосомалар
0,4 -0,8
10000
35
1,12-1,16
Қыртысты 
микросомалар
0,05- 0,2
145000
26
1,13-1,25
Тегіс 
микросомалар
0,05- 0,3
145000
25
1,06-1,23
Плазмалық 
мембраналар 
(ірі фрагменттер)
3-20
1.500
15
1,15-1,19
Көпіршіктер 
(везикулалар)
0,05-0,3
145000
30
1,07-1,19
Əртүрлі клеткалық бөлшектердің атқаратын қызметтерін терең 
зерттеу үшін оларды таза күйінде алу қажет немесе бөлшектер дəрі-
дəрмекті басқа бөлшектерден бос болуға тиіс. Осы аталған үдерісті 
субклеткалық фракциялау немесе клетка бөлшектерін фракциялау деп 
атайды. Ол мынадай үш: экстракциялау, гомогенизациялау, центрифу-
галау кезеңінен тұрады.
1. Экстракциялау. Ерекше бөлшектерді (немесе биомолекулаларды) 
бөлу үшін бірінші кезеңде оларды клеткалардан экстракциялау керек. 
Егер клеткадан белгілі бөлшектерді (немесе биомолекулаларды) бөлу 
керек болса, оларды клеткадан экстракциялау немесе бөлу қажет. 

12
Көптеген бөлшектер жəне биомолекулалар (мысалы белоктар) 
тұрақсыз болады, сондықтан олар өте жылдам биологиялық белсен-
ділігін жоғалтады. Бұл олардың сипатымен байланысты, оларды 
қолайлы жағдайларда экстракциялау қажет. Мынадай анықталған 
жұмсақ жағдайлар су ерітінді (негізінде) буферлі жүйелерді, нейтралды 
рН, төмен температураны жəне төмен осмотикалық қысымды пайдала-
ну керек. Төмен температураны (0-4°С), суық бөлмені немесе мұзды 
қолдану керек (себебі алуан гидролитикалық ферменттердің, протеа-
за, нуклеаза жəне т.б. əсері төмен болады да, бөлшектер белсенділігін 
көп өзгертпейді). Əдетте, клеткалық бөлшектерді экстракциялау үшін 
0,25 М сахарозаның концентрациясын (изоосмотикалық ерітінді), 
K
+
жəне Mg
2+
иондарды (олардың концентрациясы физиологиялық 
концентрацияға жақын болуы керек), ерітінді рН 7,4 пайдаланады. 
Буферлік жүйе ретінде (трис [гидроксиметил]-аминометангидрохлорид) 
0,05 М концентрациясын да пайдаланады. Липидтерді жəне көмір-
суларды экстракциялау үшін органикалық ерітінділердің түрлері не-
месе олардың қоспасы қолданылады.
2. Гомогенизациялау. Клеткадан бөлшектерді (немесе биомоле-
кулаларды) бөлу үшін ең бірінші клеткаларды қолайлы жағдайларда 
бұзу қажет. Клеткадан бөлшектерді алу кезеңінде ыңғайлы əдіс – 
мүшелерді бұзу, оларды гомогенизациялау. Мүшелерді кішігірім 
бөліктерге ыдыратуға келі мен келсапты (қолмен атқарылатын əдіс) 
немесе ерекше гомогенизаторды пайдаланады. Түйгішті қолданғанда 
немесе гомогенизатордың моторын айналдыру жағдайында тұтқырлық 
үйкеліс күштері пайда болады да, олардың əрекетімен клетка-
лар бұзылады. Бұзылған клетканың ішінен сахароза ерітіндісінің 
(изоосмотикалық ерітінді) құрылымы шығады. Алынған суспензияның 
ішіндегі бұзылмаған бөлшектер гомогенат деп аталады. 
3. Соңғысы – центрифугалау немесе дифференциалдық центрифу-
галау деп аталатын кезең. Гомогенат ерітіндісін субфракциясын центри-
фугалау арқылы мембраналық құрылымдарды алу ең маңызды əдіс бо-
лып саналады. Көбінесе ұлғаюдың жылдамдықпен центрифугаланған 
сатысы үш түрмен сипатталады. 
а) Центрифугалау сатысы. Гомогенатты субфракциялаудың диффе-
ренциалдық центрифугалау жолы – биотехнологияда ең маңызды əдіс. 
Классикалық жағдайда жылдамдықты ұлғайтатын центрифугалаудың 
үш кезеңі қолданылады. Əрбір үш негізгі дифференциалдық центрифу-
галау сатылардың кезеңінде жылдамдығы ұлғайған тұнба жəне жоғары 

13
тұнба сұйықтық (супернатант) қалыптасады. Гомогенатты бəсең, 
аз жылдамдықпен (600 айналымда (g), 15 мин) центрифугалағанда, 
тұнбаға ядролық фракция (оның ішінде ядролар жəне бұзылмаған 
клеткалар кездеседі) шығады жəне супернатант бөлінеді (1.1-кесте).
ə) Алынған супернатантты тағы бір рет жылдамдықты ұлғайтып 
центрифугалайды. Оның нəтижесінде тұнбаға құрамында митохон-
дриялар, лизосомалар жəне пероксисомалар бар митохондриялық 
фракциясы (10000 айналымда (g), 15 мин) мен супернатант шығады. 
б) Қалыптасқан супернатанттың жылдамдығын ұлғайтып, тағы 
бір рет центрифугалайды. Бұл центрифугалау нəтижесінде тұнбаға 
микросомдық фракция (бос рибосомалар, эндоплазмалық тордың 
бөлшектері) түседі жəне таза бояусыз ерітінді бөлінеді. Соңғысы цито-
золь немесе клеткалық шырын деп аталатын супернатант болады. 
1.1-суретте клеткалық бөлшектерді бөлу үшін субклеткалық 
фракциялаудың негізгі сатылары көрсетілген.
1.1-сурет. Клеткалық бөлшектерді бөлу үшін пайдаланылатын жалпы 
сатылар (Биомолекулы. Пептиды и белки. Методы выделения и анализа 
белков. http://yanko.lib.ru/books/biolog/nagl_biochem/84.htm)

14
Субклеткалық фракциялау нəтижелері үш факторға тəуелді: 
1) мүшелерді, клеткаларды бұзу тəсілдеріне;
2) гомогенизациялау кезеңінде қолданылатын ортаның құрамына;
3) клеткалардың түріне.
Осы аталған факторлар клеткалық құрылымдардағы мембрана-
лардың үзілу сипатын, демек, қалыптасатын фрагменттердің өлшем-
дерін анықтайды. Мысалы, плазмалық мембраналарды аз уақыт го-
могенизациялау жағдайында ядролық фракциямен бірге тұнбаға 
ірі фрагменттер түседі. Осы жағдайда микросомдық фракцияда аз 
мөлшерде клеткалық мембранадан қалыптасқан көпіршіктер түзіледі. 
Субклеткалық фракциялардың əдістері өзгеруінің арқасында 
əртүрлі клетканың бөлшектерін таза күйінде бөліп алуға болады. 
Субклеткалық фракциялау нəтижесінде үш түрлі – ядролық, мито-
хондриялық жəне микросомдық фракциялар деп аталатын тұнба пайда 
болады. Бірақ оларды өте таза күйінде алынған бөлшектер деп санауға 
болмайды. 

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: