Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер

163
Праймердің нуклеотид құрамын жəне ұзындығын басқа матрицалы 
ДНҚ ауданының дұрыс алмауы маманданбаған өнімнің пайда болу-
ына əкеп соғады. Балқу температурасының жоғарғы шегі полимераза 
əрекетінің оптимум температурасымен шектелген, белсенділігі 80°С 
жоғарғы температурада төмендейді. Праймерді таңдап алуда төмендегі 
белгiлерді ұстанған дұрыс.
СС – құрамы ~40-60%
Тт праймерлердің ұқсастығы (айырмашылық 5°С-дан артық емес).
Амплификатор. ПТР-ді, əдетте, 0,1°С аз емес нақтылықта, түтiктiң 
салқындауын жəне қызуын қамтамасыз ететін амплификаторлар 
күрделі бағдарламаларды қоюға мүмкіндік береді, соның ішінде 
«ыстық старт» мүмкіндігімен Touchdown ПТР жəне көбейтуші молеку-
лаларды 4°С сақтауға болады.
ПТР үшін қазіргі уақытта флуоресцентті детектормен жабдықталған 
құрылғылар шығарылуда. Сонымен қатар автоматизацияланған 
жүйеде құруға мүмкіндік беретін автоматты қақпасы жəне микропла-
ниетке бөлімшесі бар құралдар болады.
Реакция барысы. Маркерлі ДНҚ бар гель (1) жəне ПТР реакциясының 
өнімдерінің суреті (4.10-сурет). Əдетте, ПТР жүргізуде əрқайсысы үш 
кезеңнен тұратын 20-35 саты орындалады.
4.10-сурет. ПТР-дің жалпы жобасы 
(http://umka-vet.kiev.ua/_diagnostika/pcr.html
Денатурация. ДНҚ тізбегінің тарамауы үшін, қос тізбекті ДНҚ 
матрицасын 0,5-2 минут 94-96°С-қа дейін қыздырады (немесе, егер 
термостабильді полимераза қолданылатын болса, 98°С қыздырады).

164
Екі ДНҚ тізбегі арасындағы сулы байланыс бұзылатын болғандық-
тан, бұл кезең денатурация деп аталады. Кейде праймер мен 
матрицалардың толық денатурациясы үшін бірінші сатыдан бұрын 
(полимеразаны қоспас бұрын) 2-5 минут аралығында реакциялық 
қоспаның алдын ала қыздыруын жүргізеді. Мұндай тəсіл ыстық старт 
деп аталады, ол реакцияның ерекше емес өнім санын төмендетуге 
мүмкіндік береді.
Жасыту. Тізбек тарағаннан кейін, праймерлер біртізбекті матри-
цамен байланыса алуы үшін температураны төмендетеді. Бұл кезең 
жасыту деп аталады. Жасыту температурасы праймер құрамына 
тəуелді жəне көбіне оның балқу температурасынан төмен 4-5°С алы-
нады. Кезең уақыты – 0,5-2 минут. Жасыту температурасын дұрыс 
таңдамау праймерлердің матрицамен нашар байланысуына немесе 
дұрыс емес жерде байланысуына жəне өзгеше емес өнімнің пайда бо-
луына (төмендетілген температурада) əкеледі.
Элонгация. ДНҚ-полимераза праймерді шүрпі ретінде қолдана оты-
рып, матрицалық тізбекті репликациялайды (ДНҚ-ны екі есе көбейту 
үдерісі). Бұл кезең элонгация деп аталады. ДНҚ-полимераза матрица-
мен байланысқан 3 праймер соңынан екінші тізбек синтезін бастайды 
жəне матрица бойымен қозғалады. ДНҚ-ның элонгация температу-
расы полимеразаға тəуелді. Көбіне 72°С-та белсенді Таq- жəне Pfu-
полимеразалары қолданылады. Элонгация уақыты ДНҚ-полимераза 
типі тəрізді, көбейтуші бөліктің ұзындығына тəуелді. Əдетте, элонга-
ция уақытын əрбір мыңдаған жұп негіздеріне тең бір минуттан алады. 
Барлық кезең аяқталғаннан кейін, көбінесе барлық біртізбекті бөлікті 
құрау үшін соңғы элонгацияны қосымша жүргізеді. Бұл кезең 7-10 
минутқа созылады.
ПТР-дің І кезеңінің кескіндік көрінісі (4.11-сурет).
1. 94-96°С денатурация; 2. 68°С жасыту (мысалы); 3. 72°С элонгация 
(ДНҚ-полимераза); 4. Бірінші кезең аяқталды. 
Алынған екі ДНҚ тізбегі келесі кезеңге матрица ретінде қызмет 
етеді, сондықтан əр сатының кезегінде ДНК матрицасының саны екі 
еселенеді.
Реакцияның ерекше өнімінің саны (праймермен шектелген) 2 п/и 
шамалас өсіп отырады, мұнда n – реакция сатының саны негізінде 
əрбір сатысының тиiмдiлігі, 100% төмен болуы мүмкін, сондықтан, 
шындығында, Рn (1+Е)
n
, мұнда Р – өнім саны, Е – циклдің орташа 
тиiмдiлігі. ДНҚ «ұзын» көшірмесінің саны да өседі, бірақ ұзынынан 

165
(сызықты), сондықтан реакция өнімінде ерекше бөлік (доминатты) 
басымдылық көрсетеді.

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: