Кенжебаева Сəуле Сағындыққызы биотехнологиядағЫ Қазіргі əдістер
жүктеу/скачать 5,04 Mb. Pdf көрінісі
|
| ПТР реакция құрамдас бөлiктері. ПТР арқылы көбейтуін жүзеге
асыру үшін келесідей құрамдас бөлiктер қажет: 1) көбейтiлетін ұзындығы 100-35000 н.ж. ДНҚ бөлiгінің қамтитын ДНҚ-матрица (ДНҚ немесе бастапқы ерекше бөлiгі бар ДНҚ-ның бір бөлігі); 2) ДНҚ-ның қажетті бөлiгін клондау үшін, қарама-қарсы тізбек сандарына (ұштарына) комплементарлы олигонуклеотидті екі праймер болады. Праймерлер – анықталатын ерекше бөлiгінің шекараларын- дағы ДНҚ тізбегіне комплементарлы синтетикалық олигонуклеотид- тер (20-30 нуклеотид жұбы). Көбейтуді жүргізу сапасына ерекше бөлiкшенi таңдау жəне праймерлерді сəйкестендіріп алу шаралары маңызды рөл атқарады. 3) Тaq полимераза қоспасы – праймерлер тізбегінің ұзаруын, яғни жаңа ДНҚ тізбегіне нуклеотид негіздерінің қосылуын катализдейтін термотұрақты ДНҚ полимераза. 95° жəне одан да жоғары температу- раларда белсенділігін жоғалтпайтын термостабильді ДНҚ-полимераза. ПТР үшін қолданылатын полимераза жоғары температурада ұзақ уақыт бойы белсенділігін сақтауы керек, сондықтан термофильдерден бөлініп алынған ферменттерді пайдаланады: Thermus aquaticus (Taq – 161 полимераза), Pyrococcus Furiosus (Pfu – полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo – полимераза) жəне т.б. 4) дезоксинуклеотид үш фосфат қоспасы (дНТФ) (ДНҚ-ның жаңа тізбегінің синтезіне қажет төрт дНТФ қоспасы); 5) Мg 2+ иондары ДНҚ-полимеразаның белсенділігіне қажет. Реакцияның қажет жағдайларын қамтамасыз ететін буферлік ерітінді – рН, ерітіндінің иондық күші. Тұздар бұқаның сарысулы альбуминін құрайды. Праймердің жаңа үлесі сəйкес бөліктермен байланысып, синтездің жаңа кезеңі басталады. Тірі клеткада ДНҚ редупликациясы ДНҚ- полимераза клеткалар бөлінген кезде жүргізіледі, яғни геномды ДНҚ-ны толық көшіреді немесе синтездейді. 30 кезеңде 1 млрд бөлiк синтезделуі мүмкін. Қоспаны 94-95ºС-та қыздырады да, 60ºС-та суытады, бұл темпера- туралар қарапайым ДНҚ-полимераза қалыпты жұмыс жасауы үшін өте жоғары болады. Сондықтан ерекше фермент Tag-ДНҚ-полимераза қолданылады. Бұл фермент ыстық жерлерде тіршілік ететін Thermus aquaticus бактериялардан бөлініп алынған. ПТР əдісі соттық медици- нада, кісіні (жеке адамды) сəйкестендіру үшін, адамдардың бір-біріне туыстығын анықтау үшін қолданылады. ПТР – ерекше нуклеотид тізбегінің көшірмесін in vitro жағдайында алудың ең тиімді жолы. Олардың көбеюі үш сатының кезеңді үдерісі арқылы миллион есе артады. ПТР – амплификация келесі үш реакцияның қайталануынан тұрады. 1. Денатурация. Үлгі (бастапқы) ДНҚ молекуласын 1 мин 95°С температурада денатурациялайды ДНҚ-дан басқа реакциялық қоспада екі праймер, 4 дезоксирибонуклеотид жəне термотұрақты Tag-ДНҚ-pol болады. 2. Ренатурация. Қоспаның температурасын жайлап 55-60°С-ға дейін төмендетеді. Осы кезде праймерлер ДНҚ-ның комплементарлы тізбектерімен байланысады. 3. Синтез. Температураны Tag-ДНҚ-полимеразаға қолайлы 75°С- ға дейін көтереді. Праймердің 3'-гидроксиль тобы инициациялайтын ДНҚ-ның комплементарлы тізбегінің синтезі басталады. Барлық реакцияларды термостатқа енгізілген түтiкте жүргізеді. Температураның режимі жəне оның тұрақтылығы автоматты түрде реттеледі. Əр кезең 3-5 минутқа созылады. 162 ПТР – өте сезімтал əдіс, өйткені зерттелетін үлгіге аз мөлшерде кездейсоқ басқа реакциялық қоспадан бөтен ДНҚ түсіп кетсе, жалған нəтиже алынады. Сондықтан барлық қолданылатын ерітінділер мен ыдыстар таза, залалсыз болуы керек. Артықшылықтарымен қоса, ПТР əдісінің кейбір кемшіліктері де бар. Tag-полимераза синтезін in vitro да жүргізе отырып, бір кезеңде 1,1 × 10 -5 жиілікте комплементарлы емес нуклеотидті кірістіріп не- месе қосып жіберуі мүмкін. Қатесі бар тізбектер экспоненциалды тəуелділікпен көбейтiледі. Нəтижесінде, ПТР-дің 30 кезеңінен соң көбейтiлген ДНҚ-да 0,25% қателік болады. Əр ДНҚ-полимераза ПТР-ді əртүрлі тиімділікпен жүргізіледі. Мыса- лы, Т 4 фагының ДНҚ-pol көмегімен көбейту жүргізілгенде, көбейтiлген ДНҚ-ның бөлік 250 н.ж.-тен артық болса, ол баяу синтезделеді. Ал Tag- ДНҚ-pol мен Т 7 фагының ДНҚ-pol-сы ұзындығы 2000 н.ж. фрагментті бұдан да жылдам синтездей алады. ПТР-ді қолданып жұмыс жасай келе, бір пробиркада бірден бірнеше əртүрлі генетикалық локусты көбейту идеясы туды. Бұл жағдайда праймерлер саны бір жұп праймерден көп болады. Мұндай реакция жүктеу/скачать 5,04 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|