Дифференциалды центрифугалау əдістері

23
Клеткалық бөлiктерді тұнбаға түсіру дифференциалдық центри-
фугалау əдісі деп аталады. Оның көмегімен бөлінген клеткалық 
мембраналық құрылымдарды клетка бөлшектерінің бөлiкшелер (суб-
клеткалық бөлiкшелер) немесе клетка бөлшектерінің дəрі-дəрмектері 
деп атайды.
Бір рет центрифугалау жағдайында қалыптасқан бөлшектер таза 
күйде болмайды. Мысалы, митохондриялардың бөлiкшесінде мито-
хондриямен жəне олардың бөлiктерімен бірдей алуан мөлшерде ли-
зосомалар, плазмалық мембраналардың жəне эндоплазмалық тордың 
мембраналарымен қалыптасқан көпіршіктер кездеседі. 
Сондықтан мембраналық құрылымдарды жақсы бөлу үшін цен-
трифугалауды бірнеше рет қайталайды. Сонымен қатар қолданылатын 
ұлпаға, мүшелерге байланысты, мембраналық құрылымдарды жоғары 
иондық күші бар ерітіндімен өңдеу керек. 
Субклеткалық бөлiкше көмегімен алынған нəтижелер мүшелерді 
бұзу үшін пайдаланған əдістермен байланысты болады. Мысалы, 
мүшелерді бұзу көмегіне осмотикалық шокпен, құммен немесе шыны 
домалақпен, əртүрлі тұрпатына гомогенизатор тəуелді. Сонымен қатар 
ортаның құрамына жəне клеткалардың тұрпатына тəуелді. Аталған 
факторлар мембраналардың үзілу түріне əсер етіп, қалыптаскан 
бөлшектердің (фрагменттердің) өлшемдерін анықтайды. Мысалы, 
аз уақыт гомогенизациялау жағдайында қалыптасқан плазмалық 
мембраналардың бөлiкшеде ядролық бөлiкше кездеседі. Гомогенизаци-
ялау үдерісі аз уақыт болғанда, майда көпіршіктер қалыптасады, сол 
кезде сыртқы мембрананың бөлiкшесін эндоплазмалық тордың мем-
бранасынан бөлуге мүмкіндік болмайды. 
Бір рет центрифугаланған фракцияларды, тазарталмаған субклет-
калық бөлiкшелер деп аталатын, таза күйінде болатын фракцияларды 
немесе олардың құрамында тек бір органеллаларға сəйкес мембра-
наларды бөлу əдістері бар. Осындай əдістер сахароза немесе фикол 
заттардың градиент тығыздығын центрифугалау жəне мембраналық 
құрылымдарды тазалау əдісі деп аталады. Субклеткалық бөлiкшелерді 
тазалау үшін төмендегі аталған центрифугалау жағдайында жасау 
қажет. 
Мембраналық құрылымдарды тазалау үшін центрифугалау əдісінің 
екі: аймақтық-жылдамдықты центрифугалау жəне тепе-тең немесе 
изопикникалық центрифугалау нұсқасын пайдаланады. Осы əдістің 
негізіне буферлі ерітіндінің жəне бөлшектердің тығыздылығының 
айырмашылықтары жатады.

24
Аймақтық-жылдамдықты центрифугалауда зерттелетін үлгіні 
(мысалы, клеткалар немесе белоктар) буферлі ерітіндінің үстіне жұқа 
қабатмен салады (1.6-cурет). Гомогенатты немесе тазартылмаған 
мембраналардың бөлiкшесін аз уақыт центрифугалайды. Егер цен-
трифугалау ұзақ уақыт болса, барлық мембрандық фракциялар 
бірлікті тұнбаға шығады. Бөлшектер седиментация (тұнбаға түсіру) 
жылдамдығымен бөлінеді. Центрифугалау барысында бөлшектер 
буферлі ерітіндіден өтеді, себебі олардың тығыздылығы ерітіндінің 
тығыздылығынан көп мөлшерде артық болады. Қозғалыстың 
қарқындылығы бөлшектердің массасына жəне пішініне байланыс-
ты. Бөлшектер шыны түтікшенің түбіне жетпесе, центрифугалау 
тоқтатылады. Содан кейін шыны түтікшенің түбіне түседі жəне əртүрлі 
бөлшектері бар бөлiкшелерді жинайды. 
1.6-cурет. Аймақтық-жылдамдықты жəне изопикникалық центрифугалау
жобасы. S – седиментация (тұнбаға түсіру) коэффициенті
 (http://yanko.lib.ru/books/biolog/nagl_biochem/84.htm)
Центрифугалау барысында тығыздылықтың градиенті тұрақтануы 
үшін сахароза немесе коллоид силикагельдің ерітіндісі қолданылады. 
Олардың концентрациясы шыны түтікшенің үстінен түбіне қарай 

25
жоғарылайды. Тығыздылық градиентінің қызметі – центрифуга-
лау барысында бөліну сапасын төмендететін конвекция ағымының 
қалыптасуына кедергі жасау, нəтижесінде қоспада субклеткалық фрак-
цияларды сақтау.
Изопикникалық (немесе тепе-тең) центрифугалау жағдайында 
бөлінетін фракциялардың барлығы тығыздылық диапазонының 
градиентін пайдаланады (1.6-cурет). Изопикникалық центрифу-
галау жағдайында үлгі ерітіндісінің (əдетте, CsCl) барлық көлемі 
біркелкі үлестіріледі. Аймақтық-жылдамдықты центрифугалаумен 
салыстырғанда, осы кезде фракциялардың бөлінуіне көп уақыт кетеді. 
Центрифугалау үдерісінде тығыздылық градиентін седиментация 
жəне диффузия құрайды. Центрифугалау кезеңінде əр бөлшек оның 
қалқымалы тығыздылығына сəйкес аймақтарға тиеді. Тепе-тең күйге 
түскенде центрифугалау тоқтайды. Алынған фракцияларды жинайды 
жəне оларды зерттеулерде пайдаланады.
Клетка бөлшектерінен фракцияларды бөліп алғанда, олардың 
сəйкестігі жəне тазалау деңгейін анықтау қажет. 

жүктеу/скачать 5,04 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: