Л. Х. Гордон доктор биологических наук, профессор
Трансгенные растения с репортерными генами
жүктеу/скачать 3,42 Mb. Pdf көрінісі
|
Тарчевский
| Трансгенные растения с репортерными генами. Для ис-
следования сигнальных систем используют трансгенные растения, у которых к промотору гена, установленного ра- нее или предполагаемого участника сигнальной системы, прикрепляется так называемый репортерный ген, кодирую- щий белок, активность которого может быть определена, например белок, обладающий способностью люминесциро- вать в присутствии определенных люминофоров. Чаще все- го репортерный ген присоединяется к промоторному участ- ку исследуемого гена. Интенсивность экспрессии репортер- ных генов и распределение по органам растения или внутри клеток кодируемых ими белков достаточно легко исследо- вать по люминесценции. В большинстве случаев в качестве репортерного используется ген фермента (3-глюкуронида- зы (GUS) из энтеробактерии Е. coli. Фермент гидролизует Р-£)-глюкурониды, превращая их в D-глюкуроновую кисло- ту и агликоновый фрагмент, но может также отщеплять от полисахаридов остаток (3-глюкуроновой кислоты, связан- ный с сахарами [Gilissen et al., 1998]. Фермент проявляет активность в форме гомотетрамера, обычно локализуется в цитоплазме, но с помощью введения в репортерный ген по- следовательности нуклеотидов, кодирующей транспортный пептид, можно позволить ферменту перенос через мембра- ны и накопление, например, в эндоплазматической сети. Качественный, количественный и гистохимический анали- зы активности GUS проводятся с помощью коммерческих препаратов глюкуронидов по люминесценции продуктов реакции в присутствии люминофоров. Этот подход оказал- ся эффективным при изучении сигнального пути, "включа- емого" элиситорными белками - элиситинами. Оказалось, что молекула элиситина имеет два отличающихся участка структуры, один из которых определяет сигнальный путь, ведущий к синтезу защитных белков, а другой - к индукции некрозов [Perez et al., 1997]. Репортерный ген GUS приме- нялся также для определения структуры промоторов, на- пример, отвечающих за экспрессию генов этилениндуциру- емых защитных белков [Eyal et al., 1993], для изучения осо- бенностей регуляции сигналиндуцируемого синтеза супер- оксиддисмутазы [Herouart et al., 1994], каталазы [Guan, Scandalios, 1993], анионных пероксидаз и их локализации в различных органах растений [Mohan et al., 1993a, b; Klotz et al., 1998; Gray-Mitsumune et al., 1999], обогащенных гид- роксипролином белков клеточных стенок [Wycoff et al., 1995; Puigdomenech et al., 1997], msr (multiple stimulus response) ге- нов, от которых зависит апоптоз [Pontier et al., 1998], осмо- тинов [Zhu et al., 1995; 1996], дефенсинов [Manners et al., 1998; Mitter et al., 1998], PR1 защитных белков [Tornero et al., 1997], протеаз [Jorda, Vera, 2000], хитиназ [Clarke et al., 1994; Leah et al., 1994; Shinshi et al., 1995], р-1,3-глюканаз [Castresana et al., 1990; Vogeli-Lange et al., 1994; Alonso et al., 1995], стриктозидин-синтазы - ключевого фермента элиси- ториндуцируемого образования терпеноидных алкалоидов [Memelink et al., 1999], а также ферментов синтеза фенил- пропаноидных фитоалексинов - фенилаланин-аммиак-лиа- зы и сесквитерпенциклазы [Yin et al., 1997], 4-кумарат-ко- фермент А-лигазы [Hauffe et al., 1991]. Введение гена (3- глюкуронидазы помогло понять, как распределяется по органам и тканям калретикулиновый ген [Coughlan et al., 1997], изменяющий активность в ходе развития растений, и моносахаридный Н + - симпортерный ген [Truernit et al., 1996], экспрессируемый при действии патогенов и элиситоров. С помощью гена GUS удалось установить, что экспрессия белка оболочки вируса, обеспечивающего его транспорти- ровку по растению, локализована в тканях флоэмы вегета- тивных органов [Christou et al., 2000]. Это объясняет, поче- му скорость распространения вируса по растению значи- тельно увеличивается после его попадания во флоэму из клеток мезофилла листа [Курсанов, 1976]. Использование гена (3-глюкуронидазы, введенного под промоторы двух изоформ супероксиддисмутазы [Tanaka et al., 1995], показа- ло, что только одна из них активируется экзогенной абсци- зовой кислотой. При изучении особенностей экспрессии ге- на тримерной протеинфосфатазы типа 2А, играющей важ- ную роль в регуляции функционирования сигнальных сис- тем, GUS-метод позволил выяснить, что от набора катали- тического и регуляторных субъединиц протеинфосфатазы зависит ее специфичность, активность и распределение внут- ри клетки [Thakore et al., 1999]. Для исследования роли ионов кальция в функциониро- вании сигнальных систем используют трансгенные расте- ния с привнесенным конститутивно экспрессируемым ге- ном экворина (aequorin) [Knight et al., 1991; Chandra et al., 1997; и др.] - Са 2+ - зависимого флуоресцентного белка (из представителя кишечнополостных - Aequorea victoria), ко- торый образуется в результате посттранскрипционной мо- дификации из предшественника - апоэкворина 22 кДа. Эк- ворин локализован в цитозоле клеток, и интенсивность его люминесценции в присутствии люминофора коэлентерази- на зависит от концентрации ионов кальция в этом компарт- менте. Найдена также принципиальная возможность раз- мещения экворина в таких органоидах, как митохондрии и хлоропласты, с помощью конструирования химерных генов апоэкворина с прикрепленными к ним фрагментами, коди- рующими синтез сигнальных последовательностей, от ко- торых зависит транспорт белков в органоиды. Были найде- ны аналоги коэлентеразина, которые делают экворин более чувствительным и позволяют определять низкие кон- центрации ионов кальция [Knight et al., 1993]. Для исследования сигнальных систем клеток растений и особенностей взаимодействия патогенов и растений ис- пользуют еще один репортерный ген из Aequorea victoria - ген так называемого зеленого флуоресцентного белка [Rossi et al., 1996; Liu, Kolattukudy, 1999; Liu et al., 2001]. Практикуется получение гетерорепортерных генных кон- струкций, кодирующих как этот белок, так и (3-глюкуро- нидазу, под промотором одного и того же гена [Quaedvlieg et al., 1998; Ottenschlager et al., 1999], что предоставляет до- полнительные возможности исследования распределения и транспортировки белков, а также взаимоотношений па- тогенов и растений. С помощью гена зеленого флуорес- центного белка, введенного в геном растений табака, уда- лось установить, что вирус мозаики табака транспортиру- ется по растению с помощью двух различных механиз- мов - медленного, когда вирус передвигается от клетки к клетке, что сопровождается репликацией, и быстрого, осу- ществляющегося по сосудам растения [Casper, Holt, 1996]. Использование зеленого флуоресцентного белка под про- мотором белка движения вируса X картофеля позволило получить новую информацию о движении вирусов через плазмодесмы [Oparka et al., 1996]. В некоторых опытах определялась активность репор- терных генов хлорамфеникол-ацилтрансферазы, например, при исследовании особенностей действия патогенов и эли- ситоров на активность халконсинтазы [Loake et al., 1991; Yamada et al., 1994] - ключевого фермента синтеза фенил- пропаноидных фитоалексинов. Использование репортерного гена люциферазы для ис- ледования сигнальных систем клеток растений поставлено под сомнение в связи с тем, что субстрат этого гена (люци- ферин) сам вызывает активацию генов защитных белков IJorda, Vera, 2000]. Трансгенные растения с репортерными генами доста- точно часто конструируют для познания структуры промо- горных участков генов белков - участников сигнальных си- стем клеток растений, ферментов синтеза фитоалексинов и защитных белков. жүктеу/скачать 3,42 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|