Литература для студентов Учебная литература для студентов медицинских вузов и медицинских
жүктеу/скачать 31,79 Mb. Pdf көрінісі
|
Гистология Афанасьев 2004
| Электронная микроскопия
. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии были создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 1, Б). В электронном микроскопе используется поток электронов с бо лее короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. При напряже нии 50 ООО В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рас считано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т. е. в 100 000 раз меньше, чем в световом мик роскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешае мое расстояние составляет около 0,1—0,7 нм. В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечи вающие) электронные микроскопы (ТЭМ) (см. рис.1,Б) и сканирующие (рас тровые) электронные микроскопы (СЭМ). С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп рабо тает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно "ощупывает" остро сфокусированным элек тронным пучком отдельные точки поверхности. Для исследования выбранно го участка микрозонд двигается по его поверхности под действием отклоняю щих катушек (принцип телевизионной развертки). Такое исследование объек та называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движет ся микрозонд, — растром. Полученное изображение выводится на телевизи онный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом. Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность. Электронная микроскопия по методу замораживания — скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготов ления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При ис следовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют метал лы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии. Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в ва кууме микроскопа при —160 °С. Метод электронной микроскопии "замораживание — травление " применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образую щиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки кле ток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Ме тод позволяет выявлять трехмерную организацию структур. Таким образом, методы замораживания — скалывания и замораживания — травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией. 15 Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследо вать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, круп ных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изуча ют агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити). Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом крио- улътрамикротомии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и залив ки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре —196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамик ротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов, а также для проведе ния иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют ан титела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах. Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 ООО ООО В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1—10 мкм), так как при высокой энергии электронов они мень ше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высо ким разрешением (около 0,5 нм). Рентгеноструктурный анализ. Для изучения структуры макромолекул на атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лу чей, имеющих длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Моле кулы, образующие кристаллическую решетку, изучают с помощью дифрак ционных картин, которые регистрируют на фотопластинке в виде множест ва пятен различной интенсивности. Интенсивность пятен зависит от спо собности различных объектов в решетке рассеивать излучение. Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объекта в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре. жүктеу/скачать 31,79 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|