Нуржігіт Алтынбеков 1 Қазақстан республикасы денсаулық сақтау министрлігі
жүктеу/скачать 2,11 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Иммунды ферментті анализ, ИФА
| Иммуноэлектрофорез әдісі
Иммуноэлектрофорез әдісі ӛте сезімтал және спецификалылыгы жоғары, бұл ӛдіспен тӛмен концентрацияда және кӛп компоненттік жүйелерде антиген заттарды белгілеуге болады. Иммуноэлектрофорез екі әдістің қосылуында негізделген — электрофорез және гельдегі преципитация. Әдістің қойылуы 2 сатыдан түрады. Зерттеуге арналған затты (антигенді) олардың электрофоретикалық жылдамдық белсендігі бойынша электрофорез кӛмегімен гельде оның компоненттеріне бӛледі. Бұл үшін ерітілген гельді шынылы пластинаға құяды, ол қатып қалған соң оның ортасында шұңқыр жасайды. Зерттеуге арналган затты шұнқырға енгізіп, пластинканы электрофорез аппаратына қояды. Зерттеу заттың компоненттері әр түрлі зоналарда тасымалдайды, оларды белгілі бояулармен анықтайды. Электрофорезден кейін гельге иммундық сарысуын құйып преципитация реакциясын жүргізеді. Бұл үшін компоненттердің миграция жолдары бойынша гельде шұңқыр жасап, иммундық сарысуын шұңқырларға енгізеді. Антиденелер және электрофорезбен бӛлінген антигендік компоненттері бір біріне қарсы гельде диффузияланады, кездеседі және ертінділі емес преципитат пайдалынады. Преципитаттар әр түрлі сызықтар болып, әр жерде орналасады. Осымен бірге әрі антиген гомологиялық антиденемен жеке байланысады да жеке сызық тудырады. Сонымен, электрофорез ӛдісі зерттеу материалдың антигендік 98 компоненттерінің санын белгілейді, электрофоретикалык козғалғышы бойынша идентификацияланады және спецификалы сарысумен преципитация сызықтарының мінездемесі бойьшша. Иммунды ферментті анализ, ИФА Зертгелетін материалдың құрамындағы микробтың антигенін немесе сарысуындағы антиденелерді анықтауға мүмкіндік беретін - бұл қатты фазалық иммунды ферментті анализ (қатты фазалық иммунды сорбентті анализ). Тапсырма 3. Микробтардың антигендерін ИФА бойынша анықтау Ингредиенттері: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі антиденелер; құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал; зерттелетін микробтың антигеніне пероксидазамен (П х ) белгіленген специфихалық антиденелер; ортофенилендиамин (О ф , бұл түссіз сұйық хромоген, бірақ пероксидазамен байланысса қоныр түсі пайда болады). Полистиролды пробиркалардың қабырғасына белгілі антигенге қарсы антиденелерді (антидене қарсы антитенді) жабыстырады, зерттеуге арналған затты енгізеді, 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады. Техникасы, кезендері: 1. Белгілі антиденелер бекітілген полистиролды планшеттін ойықтарына микробтың антигені бар зерттелетін материал енгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылган арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады. 2. Пероксидазамен белгіленген антиденелер ойықтарға енгізіледі. 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады. 3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бӛлменің қаранғы орында 20 мин. ұсталады. Қатты фазалы ИФА нәтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі. Нәтижелері: зерттелетін материалдың құрамында микробтың антигендері болғанда олар ойықтардың түбіндегі антиденелермен байланысады. Пх белгіленген антигендерімен байланысады. At + Ag - Пх комплексі түзіледі. Ақырғы кезенде ойықтарға енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция. Егер зерттелетін материалда микробтың антигендері болмаса, онда буфермен шайғаннан кейін ойықтардың түбінде тек ғана белгілі антиденелер орналасады. Содан кейін енгізген Пх-мен белгіленген антиденелерде ойықтардан буфермен шайылып кетеді. Реакцияның аяғында Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция. б) Спецификалық антиденелерді анықтау Ингредиенттер: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі микробты антигендер; зерттелетін сарысу; пероксидазамен бекітілген белгілі микробты глобулинге қарсы сарысу; ортофенилендиамин. ИФА қою техникасы, кезендері: 1. Белгілі микробтың антигендері |