О книге Special for Dabl-v aka Эукариот Фрида Карловна Черкес, Лина Борисовна Богоявленская, Наталья Александровна Бельская – Микробиология

*
(
Флюрохромы: флюоресцеин дает зеленое свечение, родамин - красное.
) 
Для приготовления препаратов предметное стекло с фиксированным мазком 
(отпечатком, срезом) помещают во влажную камеру. Камеру готовят 
следующим образом. На дно чашки Петри кладут влажную фильтровальную 
бумагу. На нее параллельно укладывают две стеклянные палочки (можно 
использовать широкую часть пастеровских пипеток). На них мазком вверх 
помещают предметное стекло. 
Внимание! Не забудьте мазок с обратной стороны обвести восковым 
карандашом. 
На мазок наносят каплю люминесцирующей сыворотки. Закрывают чашку 
и помещают в термостат или оставляют при комнатной температуре на 20-30 
мин. После инкубации промывают забуференным изотоническим раствором 
(рН 7,4), ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, наносят каплю 
забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом (не толще 0,17 мм!) 
и рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть 
микробы, гомологичные антителам люминесцирующей сыворотки, они ярко 
светятся на темном фоне. Этот метод называется прямой (рис. 36). Неудобство 
прямого метода РИФ состоит в том, что для его постановки необходимы 
люминесцирующие сыворотки к каждому определяемому антигену, готовить 
которые сложно, а полного набора готовых люминесцирующих сывороток к 
любому антигену нет. Поэтому пользуются часто непрямым методом. Он 
заключается в том, что на первом этапе препарат обрабатывают 
нелюминесцирующей иммунной специфической сывороткой к искомому 
антигену. В случае, если в препарате имеются искомые антигены (микробы), 
то образуется комплекс антиген - антитело, который увидеть нельзя. После 
высушивания, на втором этапе препарат обрабатывают люминесцирующей 
сывороткой, содержащей антитела не к искомому антигену, а к глобулинам 
того вида животного, от которого получена специфическая сыворотка. 
Например, если первая сыворотка получена при иммунизации кролика, то 
вторая должна содержать антитела к кроличьим глобулинам (см. рис. 36). Эти 
антитела соединяются с глобулинами специфической сыворотки, которые 
адсорбировались на искомом антигене, и комплекс светится при 
рассматривании препарата в люминесцентный микроскоп. 

 
Рис. 36. Схема реакции иммунофлюоресценции (РИФ). I - прямой метод: II - 
непрямой метод: а - 1-й этап постановки реакции; б - 2-й этап постановки 
реакции: 1 - изучаемый антиген: 2 - люминесцирующее антитело к 
изучаемому антигену; 3 - нелюминесцирующее антитело к изучаемому 
антигену 4 - люмннесцирующее антитело к глобулинам животного, от 
которого получены антитела к изучаемому антигену; 5 - светящийся 
иммунный комплекс: 6 - несветящийся иммунный комплекс 
Опсонофагоцитарная реакция 
Опсонофагоцитарная реакция (ОФР) является одним из методов оценки 
активности иммунного фагоцитоза. Чем эта активность выше, тем выше 
устойчивость организма к инфекции. В иммунном организме под влиянием 
антител (опсонинов) фагоцитоз протекает активнее (поглощается большее 
количество микробов в более короткий срок). Поэтому показатели 
фагоцитарной активности имеют не только диагностическое значение 
(например, при бруцеллезе), но и позволяют прогнозировать исход 
инфекционного процесса, оценивать результаты лечения и вакцинации. Для 
реакции необходимы: 
1. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов. 
2. Антитело (опсонины) - исследуемая сыворотка. 
3. Фагоциты - обычно нейтрофилы исследуемой крови. 
Постановка реакции. С помощью микропипетки в небольшие пробирки 
наливают 0,05 мл 2% раствора натрия цитрата; 0,1 мл исследуемой крови и 0,05 
мл взвеси микроорганизмов, густота которой соответствует в 1 мл 10 ед. 
мутности по оптическому стандарту ГИСК. 

Внимание! Для каждого ингредиента должна быть использована отдельная 
пипетка. 
Содержимое пробирок перемешивают. Пробирки ставят в термостат на 30 
мин, после чего вновь перемешивают их содержимое и готовят тонкие мазки 
(как мазки крови). Окрашивают по Романовскому - Гимзе. 
Учет результатов. В разных местах мазка подсчитывают 25 нейтрофилов, 
учитывая в каждом из них количество захваченных микроорганизмов. 
Показатель опсонофагоцитарной реакции (ПОФР) вычисляют по формуле: 
ПОФР = 3а + 2б + 1с + 0, 
где а - число нейтрофилов, содержащих свыше 41 бактерии; б - число 
нейтрофилов, содержащих от 21 до 40 бактерий; с - число нейтрофилов, 
содержащих от 1 до 20 бактерий; 0 - число нейтрофилов, не содержащих 
бактерии. 
Максимальный показатель опсонофагоцитарной реакции при такой системе 
учета составляет 75. 
Результат реакции оценивают по следующей схеме: 
при ПОФР от 1 до 24 - слабоположительный; 
при ПОФР от 25 до 49 - ясновыраженный; 
при ПОФР от 50 до 75 - резкоположительный. 
У здоровых людей ПОФР составляет 0-1, редко 4-5. Ясновыраженный и 
резкоположительный 
результаты 
реакции 
говорят 
о 
высоком 
опсонизирующем действии сыворотки обследуемого лица с выраженной 
активностью фагоцитов крови. 
Определение только активности антител - опсонинов проводится опытом 
установления опсоиического индекса - отношения фагоцитарного показателя 
в присутствии иммунной (исследуемой) сыворотки к фагоцитарному 
показателю в сыворотке, заведомо не содержащей антител к данному микробу. 
Опыт ставят так: берут 2 пробирки, в одну из которых (опытную) вносят в 
равных количествах (обычно по 0,2 мл): 1) сыворотку обследуемого лица; 2) 
взвесь микробов, в котором определяют наличие опсонинов; 3) лейкоциты 
(можно из брюшной полости мыши). В контрольную пробирку вносят: 1) 
сыворотку без опсонинов (контрольную); 2) те же микробы, что и в опытную; 
3) лейкоциты (те же, что и в опытную пробирку). 
Обе пробирки выдерживают в термостате в течение 30 мин, а затем из той и 
другой готовят мазки, фиксируют и окрашивают по Романовскому - Гимзе. 

Микроскопируют мазки и определяют фагоцитарный показатель в опытной и 
контрольной пробирках. 
При наличии опсонинов в исследуемой сыворотке опсонический индекс 
будет больше единицы. Чем больше число, полученное от деления показателя 
фагоцитоза исследуемой на фагоцитарный показатель контрольной 
сыворотки, тем более выражено действие антител - опсонинов. 
Контрольные вопросы 
1. На каком свойстве антител основана ОФР? Специфична ли эта реакция? 
2. О чем свидетельствует показатель ОФР, равный 75? 
Задание 
Исследуйте ОФР крови, взятой из пальца. Зарисуйте фагоциты. Вычислите 
ПОРФ. 
Реакции иммунитета in vivo (кожаные пробы) 
При нанесении антигена на скарифицированную кожу или введении 
внутрикожно можно выявить как иммунное состояние, так и состояние 
повышенной чувствительности к данному препарату. 

жүктеу/скачать 14,39 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: