О книге Special for Dabl-v aka Эукариот Фрида Карловна Черкес, Лина Борисовна Богоявленская, Наталья Александровна Бельская – Микробиология

При наблюдении неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от 
окружающей среды только по показателю преломления, изменения 
интенсивности не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых 
волн. Поэтому глаз изменений заметить не может и эти объекты выглядят 
малоконтрастными, прозрачными. 
Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную 
микроскопию, основанную на превращении фазовых изменений, вносимых 
объектом, в амплитудные, различимые глазом. 
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом 
биологическом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов со 
специальными фазовыми пластинками; 2) конденсора с поворачивающимся 
диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым 
пластинкам в каждом из объективов; 3) вспомогательного микроскопа. 
Настройка фазового контраста в основном заключается в следующем: 
1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные; 
2) устанавливают объектив малого увеличения и отверстие в диске 
конденсора без кольцевой диафрагмы (обозначенное цифрой "0"); 
3) настраивают свет по Кёлеру; 
4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и 
фокусируют его на препарат; 
5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую 
объективу кольцевую диафрагму; 
6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный 
микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка 
(в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того 
же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно 
совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь 
устанавливают окуляр. 
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых 
неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят 
темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на 
темном фоне (негативный фазовый контраст). Наша промышленность 
выпускает устройство КФ-4 для позитивного фазового контраста. 
Фазово-контрастная микроскопия широко применяется также для изучения 
клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и 
т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным 
расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У 

таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. 
Иногда они заключены в термостат для наблюдения за динамикой изменений 
в клетках культуры ткани и снабжены кинокамерой. 
Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с 
помощью описанных выше способов микроскопии. К ним относятся 
различные спирохеты и, в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. 
Для наблюдения этих микроорганизмов применяют темнопольную 
микроскопию. 
Темнопольная микроскопия 
Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов 
сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются 
обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. 
Существует несколько типов таких конденсоров, различающихся по 
устройству. 
Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что 
центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив 
микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в 
объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, 
находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте 
Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в 
воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. 
Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура его 
должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в 
обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными 
объективами, снабженными ирисовой диафрагмой. 
При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко 
светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть 
обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за 
пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная 
микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает 
возможности изучить внутреннюю структуру. 
Обычно с помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа 
"раздавленная капля". При этом очень строгие требования предъявляются к 
качеству предметных и покровных стекол и приготовлению препарата. 
Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные - 0,17 мм, 
без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует обращать 
особое внимание на отсутствие пузырьков и крупных частиц (все эти дефекты 
будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). 

Для темнопольной микроскопии необходимы яркие источники света, 
поэтому следует применять более мощные осветители и максимальный накал 
лампы. 
Настройка темнопольного освещения в основном заключается в 
следующем: 
1) устанавливают свет по Кёлеру; 2) заменяют светлопольный конденсор 
темнопольным; 3) на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло 
или в крайнем случае дистиллированную воду; 4) поднимают конденсор до 
соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла; 5) объектив 
малого увеличения фокусируют на препарат; 6) с помощью центрировочных 
винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее 
затемненный центральный участок); 7) поднимая и опуская конденсор, 
добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения 
равномерно освещенного светлого пятна. Если этого сделать не удается, то 
надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление 
наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус 
света фокусируется в толще стекла). 
После правильной настройки света устанавливают объектив нужного 
увеличения и исследуют препарат. 
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия 
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности 
некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении 
невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Примером такого свечения 
являются известные всем лампы дневного света, в которых в результате 
облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав - 
люминофор, покрывающий изнутри колбу лампы. 
Цвет люминесценции обычно смещен в более длинноволновую часть 
спектра по сравнению с возбуждающим ее светом. Так, если люминесценция 
возбуждается синим светом, то цвет ее может быть от зеленого до красного, 
если люминесценция возбуждается невидимым ультрафиолетовым 
излучением, то цвет ее может быть в любой части видимого спектра. Эта 
особенность 
люминесценции 
позволяет, 
используя 
специальные 
светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно 
слабое люминесцентное свечение. 
Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним 
отличаются от обычного светового микроскопа в основном следующим: 
1. Наличие мощного источника света в осветителе, излучающего 
преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части 
спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления). В специальных 

люминесцентных осветителях, которые устанавливают на обычный 
микроскоп, применяют кварцевые галогенные лампы (КГМ). 
2. Наличие системы светофильтров: а) возбуждающие светофильтры 
пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию; 
б) теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие 
светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа. В 
отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию 
кроме того выполняет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполненная 
дистиллированной водой. Эта кювета установлена непосредственно после 
коллектора. 
При работе с люминесцентным микроскопом надо обращать особое 
внимание на то, чтобы эта кювета была полностью заполнена водой и чтобы 
вода была абсолютно чистой и прозрачной, поскольку при длительной работе 
микроскопа в воде могут размножаться микроорганизмы и она мутнеет; 
в) "запирающие" светофильтры расположены между препаратом и 
окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и 
пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя. 
В нашей стране разработан очень эффективный способ освещения 
препаратов для возбуждения люминесценции, который используется во всех 
отечественных люминесцентных микроскопах. Этот способ заключается в 
том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. 
Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, 
имеющих большую числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для 
изучения микроорганизмов. Очень важную роль при этом способе освещения 
играет специальная интерференционная светоделительная пластинка, 
направляющая свет в объектив и представляющая собой полупрозрачное 
зеркало, которое избирательно отражает и направляет в объектив только ту 

жүктеу/скачать 14,39 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: