Тіршілікке қабілетті протопластарды алу

Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты: лпаның шығу тегі (жапырақ, тұқымжарнақ, тамыр, тозаң түйірі, каллус ұлпасы, суспензиядағы жасушалар), өсімдіктің түрі мен сорты, өсімдіктің физиологиялық күйі, ферменттердің құрамы, олардың сапасы, ортаның рН және осмостық заттың түрі.

Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың санымен белгіленеді. Протопластардың саны Фукс-Розенталь камерасында есептеледі. Протопластың тығыздығы (суспензияның 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы. Егер ұлпаның немесе өсірілген жасушалардың ылғалды массасының 1 граммынан 1х_тен 5х_ дейін тіршілікке икемді протопластар шықса, онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі.

Протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардың өміршеңдігі өсімдіктің түріне, жасына және физиологиялық күйіне, яғни генетикалық және эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты.

Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайлы өсу кезеңін, нақтылы бір мүшесін анықтап таңдап алу қажет.

In vitro өскен жасушалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай өз артықшылықтары бар: стерильдік, in vitro жағдайында өсуге бейімділік. Бірақ жасуша қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және оның қалыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады. Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген жасушалардың ішінде меристемалық жасушаларының сан жағынан үлесіне сай болады, ал ол үшін суспензиядағы жасушаларды жиі-жиі (2-3 тәулігінде) жаңа қоректіа ортаға көшіріп отыру керек.

Суспензияда өсірген жасушалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мезгіл, ол жасушалардың өсу кезеңінің логарифмдік фазасының соңында. Осы мезгілде жасуша қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап, өміршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке икемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты. Жасушаның плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді. Бұ жағдайда цитоплазманың вакуольденуі артады, көптеген липид тамшылары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядро мен хлоропластар қоюланады.

Фермент препаратының сапасы протопластардың бөліп алынған санына, мөлшеріне ғана емес, олардың кейбір қасиеттеріне де әсер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препараттарына қоспа ретінде протеазалар, липазалар, нуклеазалар және басқа ферменттер, фенолдық қосылыстар, тұздар кіреді. Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін. Осы токсикалық заттардан құтылу үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады. Бірақ айта кететін мәселе, өте жақсы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді. Кейде ферменттер ерітіндісіне қорғаушы заттар (протекторлар) қосылады, мысалы, декстранның немесе калий сульфатының 0,5% ерітінділері. Олар протеиндермен әрекеттесіп, ферменттердің зиянды әсерін төмендетеді.

Инкубациялық ортада иондардың, әсіресе кальций мен магнийдің болуы, плазмалемманың тұрақтылығын арттырып, оқшауланған протопластардың сапасын жақсартады. Оқшауланған протопластар механикалық және осмостық стреске өте сезімтал болады. олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде өздерінің осмостық тұрақтылығын сақтай алады.

Ферменттік ерітіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып, біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бұзылған құрылымдары репарацияланып, қабығын қайта құруға дайындалады.
№11 дәріс: Сомалық будандастыру.