ОңТҮстік қазақстан медицина академиясы, хабаршы №4 942, 2021 жыл, том 2
жүктеу/скачать 3,39 Mb. Pdf көрінісі
|
№4942021том2
|
Нәтижелері Ақуызды-ақуыз өзара әрекеттесуін тексеру үшін аффинн сорбентте (Pull down assay) ақуыз преципитациялау әдісі қолданылды. Бұл әдіс зерттелген ақуыздар арасындағы өзара әрекеттесуді болжауға мүмкіндік береді. Біз аффиндік сорбенттер алдық. Матрица ретінде Sepharose cl-4B сорбенті, алдын-ала белсендірілген BrCN болды, ол арқылы кавеолин-1 (CavY) N-терминалды фрагменттері бар амин топтары арқылы ковалентті түрде иммобилизацияланды және оның фосфорланған формасының мимикасы (CavE) (14 позициядағы тирозинді аминқышқылын фосфорланған күйге сәйкес келетін зарядты глутамин қышқылына ауыстыру). CavY кавеолиннің жабайы түрі-1-ге сәйкес келеді, ал CavE тотығу стрессінде жиі кездеседі. Алынған сорбенттердің рекавериннің әртүрлі нысандарымен өзара әрекеттесуіне зерттеу жүргізілді. Тәжірибелерде жабайы типтегі протеинге сәйкес келетін қалпына келтірудің мономерлі формалары қолданылды, өйткені бұл көру жүйесінің қалыпты жұмыс істеуі үшін қажетті кең таралған формалар, тотығу стрессі кезінде торлы қабықта жиналатын ақуыздың үлгісі ретінде димерлі формалар қолданылады. Жүргізілген эксперименттердің нәтижесінде біз CavY және CavE функционалды доменін қамтитын N-терминалды фрагменттердің sepharose CL-4B аффинн сорбентінде иммобилизацияланған мономермен және ірі қара мал мен адам рековеринінің димерімен жеткілікті тұрақты ақуыз кешенін құра отырып, жеке- жеке (in vivo кавеолиндері әдетте олигомерленуі мүмкін) екенін анықтадық. Преципитацияланған ақуыздарды жуу үшін қолданылатын буферде 0,1% Tween-20 иондық емес детергент болғандықтан, спецификалық емес байланыстарды бұғаттайды. Бұл детергентті қолдану аффинсіз ақуызды-ақуыздың өзара әрекеттесуінің қатаң шарты болды және жалған оң нәтижелерді барынша азайтты. Сондай-ақ, фоторецептор жасушасының әр түрлі физиологиялық күйіне сәйкес келетін жағдайлар таңдалды (кальций иондарының болуы және болмауы жағдайында), онда мономер мен ірі қара мал мен адам өзендерінің димері кальций иондарының болмауы жағдайында CavY және CavE-мен қарқынды әрекеттескен, бұл осы процестің кальций сезімталдығын көрсетеді (сур. 1). Сурет. 1. Ірі қара мал және адам рековеринінің мономері мен димерінің CavY және CavE-мен әрекеттесуін Pull down assay әдісі арқылы талдау. жүктеу/скачать 3,39 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|