Курс лекций для студентов специальности -48 02 01 «Биотехнология» Минск 2014 034)

133 
Сверхсинтез лимонной кислоты мицелиальными грибами обеспе-
чивается лимитированием роста грибов одним или несколькими ми-
неральными компонентами среды (Fe, Mn, N, P), избыточным содер-
жанием источника углерода и низкой величиной рН ферментационной 
среды. Гриб прекращает рост после полного поглощения из среды де-
фицитного элемента, но продолжает потреблять имеющийся в среде 
источник углерода. В клетках гриба накапливается лимонная кислота, 
которая не может метаболизироваться в цикле трикарбоновых кислот 
из-за ингибирования ряда ферментов (аконитазы, изоцитратдегидро-
геназы и др.) и выделяется в окружающую среду. 
Посевной материал Aspergillus niger получают в виде конидий. 
В производственных условиях посевной материал накапливают в кю-
ветах площадью 10–12 дм
2
на агаризованной среде следующего соста-
ва: пивное сусло, разбавленное до 7% по сахарометру; 1–2% NaCl, 
0,1% мочевины, 0,001 мг% CuSO
4
, 2–3% агара. 
Среду разливают в 10–20 алюминиевых кювет слоем толщиной 
1,5 см, засевают конидиями с помощью пульверизатора и выдержи-
вают в растильной камере 7–8 сут. 
На поверхности среды развивается плотная мицелиальная пленка, 
покрытая конидиями. Пленку подсушивают в растильной камере при 
температуре 32
С в течение 1–2 сут. Кюветы просматривают в стериль-
ном боксе и отбраковывают по морфологическим признакам (незрелое 
спороношение или инфекция). Конидии собирают с поверхности пленки 
отсасыванием воздуха специальным устройством (работающим по 
принципу пылесоса), подсушивают в термокамере при 28–30
С, а затем 
смешивают со стерильным активированным углем (марки КАД) в соот-
ношении 1 : 2 и расфасовывают в стерильные колбы (или банки) емко-
стью 0,5–1,0 л, закрытые ватными пробками. Хранят посевной материал 
при комнатной температуре, избегая воздействия прямых солнечных лу-
чей. Срок годности спорового материала – 6 месяцев. 
При производстве лимонной кислоты применяют поверхностное 
или глубинное культивирование гриба-продуцента на мелассной среде. 
Меласса содержит большое количество микроэлементов (прежде всего 
железа), которые затормаживают кислотообразование. Поэтому мелассу 
обрабатывают желтой кровяной солью K
4
[Fe(CN)
6
] при кипячении рас-
твора в течение часа. В результате соли железа и других тяжелых эле-
ментов осаждаются и удаляются из раствора, раствор стерилизуется. 
При поверхностном культивировании гриба Aspergillus niger Р-3 исполь-
зуют раствор мелассы с содержанием сахарозы 13
15%. 

134 
Стерильный раствор по пропаренным коммуникациям подается 
в кюветы прямоугольной формы размером 1,5×6,0 м (высота слоя 
жидкости в кювете – 12 см), расположенные в растильной камере. 
Каждая кювета имеет внизу штуцер для подачи и слива раствора. 
Штуцера всех кювет соединены с расположенным вне камеры верти-
кальным коллектором, через который в кюветы подается и выводится 
раствор. К каждому ярусу кювет по воздуховодам поступает стериль-
ный кондиционированный воздух. Среду в кюветах засевают кони-
диальным посевным материалом (50–100 мг конидий на 1 м
2
площади 
кювет), который специальным устройством распыляется в воздушном 
потоке и через воздуховоды поступает на поверхность среды. 
В первые 24–36 ч роста гриба интенсивность аэрации растильной 
камеры составляет 3–4 м
3
/(м
2
 ч) при температуре воздуха 34–36С, 
затем подачу воздуха увеличивают до 18 м
3
/(м
2
 ч), а температуру 
понижают до 30–32
С. 
Максимальный рост мицелия гриба достигается на четвертые 
сутки культивирования. Мицелий гриба в виде прочной пленки 
покрывает всю поверхность раствора. В процессе ферментации 
происходит постепенное нарастание общей кислотности. Начальное 
значение рН среды 6,8–7,0 снижается в течение первых трех суток до 
4,5, а к концу процесса – до 3,0. Максимальная активность кислото-
образования пленки гриба наблюдается на 5–6 сут. (около 100 г 
кислоты на 1 м
2
пленки в час) и далее сохраняется на высоком уровне 
(50–60 г/(м
2
 ч)). 
Различают три режима поверхностного культивирования: бес-
сменный, односменный, бессменный с доливами (доливной). При бес-
сменном режиме гриб культивируют на одной и той же питательной 
среде до окончания кислотообразования (8–9 сут.). Односменный 
режим отличается тем, что через 6–7 сут. культуральную жидкость 
сливают, пленку гриба промывают стерильной водой и заливают под 
пленку новый раствор. При высокой активности пленки гриба сменить 
раствор можно не один, а даже несколько раз. 
Наиболее эффективным является доливной способ, суть которого 
заключается в том, что, начиная с 5–6 сут. культивирования гриба, 
через каждые 36–48 ч проводится долив питательной среды (один или 
несколько раз) под пленку гриба в количестве 30–35% от начального 
объема. Общая продолжительность процесса возрастает до 11–12 сут. 
Доливной режим обеспечивает увеличение выхода лимонной кислоты 
с 1 м
2
поверхности кювет на 15–20% и снижает удельный расход 
мелассы на 10–15% по сравнению с другими методами. 

135 
Ферментацию прекращают при снижении содержания сахара в рас-
творе до 1–2%. Общая кислотность ферментационного раствора дости-
гает 20%. Кроме лимонной кислоты в культуральной жидкости присут-
ствуют глюконовая, щавелевая и некоторые другие кислоты. На долю 
лимонной кислоты приходится 90–98% от всех органических кислот 
в растворе. Выход лимонной кислоты от сахарозы составляет 68–80%. 
После слива культуральной жидкости под пленку гриба для про-
мывки подают горячую воду (70–75°С). Кислую промывную воду 
присоединяют к основному раствору. Инактивированный мицелий 
после высушивания используют в качестве кормовой добавки. 
При глубинном способе культивирования продуцентов лимонной 
кислоты применяют специально отселекционированные природные 
или мутантные штаммы Aspergillus niger. Штаммы, используемые в ка-
честве продуцентов при поверхностном культивировании, непригодны. 
Для глубинного культивирования гриба готовят два мелассных 
раствора: основной (3–4% сахара) и доливной (25–28% сахара). Ос-
новной раствор обогащают минеральными компонентами (NH
4
Cl, 
MgSO
4
, K
2
HPO
4
), мелассу освобождают от железа и других металлов 
обработкой желтой кровяной солью. Солевой и мелассный растворы 
стерилизуют раздельно на УНС при температуре соответственно 120–
125
С и 128–130С. Для засева производственного ферментатора при-
меняют посевной материал в виде мицелиальной массы гриба, полу-
ченной из конидиального материала выращиванием глубинным мето-
дом в течение 30–36 ч в посевном аппарате на основном растворе. 
Ферментация длится 5–7 сут. при температуре 32–33
С и постепен-
ном увеличении уровня аэрации в течение суток с 2 до 20 м
3
/(м
3
 ч). 
Начиная со вторых суток культивирования, производят 2–3 долива ме-
лассным раствором из расчета достижения конечной концентрации са-
хара в ферментационной среде 12–15%. По окончании процесса культу-
ральную жидкость нагревают до 60–65
С и отделяют мицелий фильтро-
ванием с промывкой горячей водой. Фильтрат содержит 5–12% органи-
ческих кислот (в зависимости от качества мелассы и активности штам-
ма), количество лимонной кислоты – 80–95% от общей суммы кислот. 
Несмотря на общие преимущества глубинного способа, производ-
ство лимонной кислоты поверхностным культивированием продуцен-
та является более экономичным: энергетические затраты и себестои-
мость продукта значительно ниже. На практике в промышленном 
производстве лимонной кислоты применяют оба метода. 
Лимонную кислоту выделяют из раствора в виде труднораство-
римой соли кальция (рис. 13.2). 

136 
Рис. 13.2. Схема выделения лимонной кислоты из культуральной жидкости 
Инактивированный 
мицелий на корм 
Культуральная
жидкость 
Известковое или 
меловое молоко 
Отделение мицелия гриба
фильтрованием
с промывкой горячей водой 
Нейтрализация
органических кислот
Отделение осадка фильтрованием 
(цитрат и оксалат кальция)
с промывкой горячей водой 
Разложение цитрата кальция
серной кислотой 
Отделение гипссодержащего 
шлама фильтрованием 
Упаривание фильтрата
под вакуумом
до плотности 1260 кг/м
3
Отделение выпавшего в осадок 
гипса фильтрованием
Упаривание концентрата под ва-
куумом до плотности 1360 кг/м
3
Охлаждение концентрата
и кристаллизация
лимонной кислоты
Отделение кристаллов
центрифугированием с промывкой
деионизированной водой
Сушка кристаллов
в барабанной сушилке
Лимонная кислота 99,5% 
Фильтрат,
содержащий
глюконат кальция 
Сульфид бария 
Серная кислота 
Активированный 
уголь 
Шлам, содержащий 
оксалат кальция,
гипс и активиро-
ванный уголь 
Конденсат паров 
Гипс 
Конденсат паров 
Маточный раствор 
Затравка 

137 
Культуральную жидкость нагревают до кипения и нейтрализуют 
известковым или меловым молоком до рН 7,0–7,5. Цитрат и оксалат 
кальция образуют осадок, а глюконат кальция и основная часть орга-
нических и минеральных веществ мелассы остаются в растворе. 
Осадок промывают горячей водой и разлагают цитрат кальция 
серной кислотой при таких условиях, когда оксалат кальция остается 
в осадке. Разложение цитрата осуществляют при температуре 60
С 
после взмучивания осадка в воде (1 : 3 по массе) в присутствии акти-
вированного угля для осветления раствора (2% к массе лимонной кис-
лоты) при перемешивании в течение 20 мин и расходе серной кислоты 
0,425 дм
3
на 1 кг лимонной кислоты в цитрате. В конце процесса в ре-
актор вводят сульфид бария для осаждения тяжелых металлов. 
Раствор лимонной кислоты, полученный в реакторе, отделяют 
фильтрованием от осадка, содержащего гипс, оксалат кальция, уголь, 
сульфиды металлов. Фильтрат упаривают под вакуумом при темпера-
туре 70
С в две ступени, в промежутке между которыми отделяют 
фильтрованием выпавший в осадок гипс. На первой ступени фильтрат 
упаривают до плотности 1240–1260 кг/м
3
, на второй – до 1350–
1360 кг/м
3
, что соответствует концентрации лимонной кислоты в рас-
творе около 80%. 
Концентрат охлаждают до температуры 8–10
С и кристаллизуют 
лимонную кислоту в присутствии затравки – мелких кристаллов ли-
монной кислоты – в течение 40–50 мин. Кристаллы отделяют центри-
фугированием с промывкой деионизированной водой и отжимом до 
влажности 2–3%. Высушивают кристаллы в барабанной сушилке го-
рячим воздухом при температуре 35
С. 

138 

жүктеу/скачать 1,87 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: