Практикалық жұмыс №1
жүктеу/скачать 1,33 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Оқыту міндеттері
| Практикалық жұмыс №12
Тақырып: Рекомбинанттық ДНҚ-ны клеткаларға енгізу Сабақтың мақсаты: Рекомбинанттық ДНҚ-ны клеткаларға енгізуді меңгеру Оқыту міндеттері:- Рекомбинантты ДНҚ туралы түсінік қалыптастыру - Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыруды игеру;Сабақтың мазмұны: Генетикалық инженерияның негізгі мағынасы болып рекомбинантты ДНҚ системасын құрастыру міндеті саналады. Рекомбинатты ДНҚ деп in vitro жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген екі немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады. Генетикалық инженерияның формалды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы II. Бэрг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмдердің - маймылдың рак вирусының, фагтың және бактериялық плазмиданың (вектордың) - ДНҚ фрагменттерінен бірінші рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Дегенмен, бұл ДНҚ-ның клеткада жұмысістей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак вирусының гені болғандықтан П. Бэрг тәуекелге бармады. Дәл осы кезде Лобан да осындай рекомбинантты ДНҚ молекуласын алу мүмкіндігін көрсетті. Бұл кезде рестриктазалар және оның қасиеттері ашылған болатын. 1973 ж. С. Коэн және Г. Бойер плазмида негізінде векторларды құрастыру үшін рестриктазаларды пайдалану керектігін алғаш түсінді. Олар 1974 ж. клеткада кәдімгідей жұмыс істей алатын рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ құрастыру жолдары жаңа ғылыми дәйектермен толтырылды және жетілді, ал олардың негізгі принциптері II. Лобан жәно С. Коэн ндеяларына сүйенеді. Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған әдісі рестриктазаларды қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар әдісі деп аталады.Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бөтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. ‘Жабысқақ ұштар әдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзетіп рестриктазаларға сүйенеді. Рекомбинантты ДНҚ-ны жабысқақ ұштар әдісі бойынша құрастырудың жақсы жақтары және кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатынбөліктердің қалпына келуі әдістіңжақсы жағын сипаттайды.Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы рестриктазаныңәсерімен салыстырмалы оңай бөліп алуға мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің – жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек. Бұдан басқа бұл әдістің күрделілігі бар: рестриктаза танитын нүктелер эксперимент үшін ыңғайлы бөлікте орналаспауы мүмкін, мысалы, олар қажет геннің ішіне локализацияланады. ДНҚ-ның кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа әдістер де бар. Гомополимерлі ұштар әдісінде немесе конекторлық симметрия өсімен үзетін рестриказа арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің «доғал» ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бөлігі жоқ) терминалдық трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы ДНҚ-ның 3’ - ұштарына поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ-ның 3’ - ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бетен ДНҚ және вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзеп, оңай бір молекулаға бірігеді. Немесе ДНҚ фрагментіне де, вектордың ұшына да синтетикалық қос тізбек (линкер) жалғайды. Сонан соң линкерді танитын және оны жабысқақ етіп рестриктазамен үзеді. Осылайша бұл жолмен де жабысқақ ұштар алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың бұл әдісі Лобан-Берг идеясына сүйенеді. Рекомбинанттық ДНҚ технологиясы клетканы зерттеуде төңкеріс жасады. Қазіргі кезде реструктуралаушы нуклсазаларды пайдалана отырып, клетка ДНҚ-нідің кез-келген бөлігін кесін алуға, клондауға және осы генетикалық материалды шексіз мөлшерде алуға, содан соң оның кезектесуін күніис бірндес жүздеген нуклеотидке дейін анықтауға болады. Осы әдіснен эукариоттардың көптеген өндерінің және қоюмдарының кодталмайтың бөдіктері анықталған. Нуклеин қышқылдарының гибридизациясы әдісіп қолдана отырып, клеткасыз жүйеде клондалған ДНҚ-молекулаларына сәйкес иРНК молекулаларын анықтауға, бөліп алуға және трансляциялауға болады. Сондай-ақ кері бағытқа қаран да баруға - белоктан оны қозгайтын генге қарай, янғи белоктың кысқа фрагменттерінің амин қышқылдық кезектесуін анықтап, осы белокты кодтайтыи сэйкес РНҚ мен ДНҚ-мен гибридизацияланатын маманданған арнайы ДНҚ-зондтар сиитездеугсболады. Рекомбинантты ДНҚ технологияларының мүмкіндіктері жоғары. Шексіз мөлшерде сүт қоректілердіц ақуызын синтездейтін бактериялар немесе ашытқылар жасалуы мүмкін. Бұл ақуыздың структурасы мен функциясын анализдеуге немесе медициналық мақсатта қоданылатын (вакиина немесе дәрілік препараты) ақуыздар алуға мүмкіндік берді. Ең негізгі әдістер: 1) ДНҚ-ны арнайы рестриктуралаушы нуклсазалармен ыдырату. 2) Нуклеин қышқыдарының гибридизациясы. Ол нуклеин қышқылынын өзара комплементарлы бөліктерге байланыса отырып жоғары дәлдікпен ДНҚ мен РНҚ-ныц нуклеотидтік кезектесуін анықтауға мүмкіндік береді. 3) Белгілі бір ДНҚ фрагменттерін жылдам репликацияланатын генетикалық элементтерге (плазмида, вирустар) енгізу үшін қолданылатын ДНҚ-ны клондау. 4) Клонданатын ДНҚ фрагментіндегі нуклеотидтердід кезектесуін анықтау. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі — доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану өте ыңғайлы. Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш әдісінің бірнеше модификациялары (өзгешеліктері) бар және де ген мен векторлықмолекуланың ерекшелігіне байланысты методологиясы әртүрлі болуы мүмкін.Көпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады. жүктеу/скачать 1,33 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|