Реферат Тақырыбы : Ірі қара малының blad және сvм тұқым қуалайтын аномалиялары
Асыл тұқымды малдардың жасырын генетикалық детекциялық ақауларын баламалдау әдістері
жүктеу/скачать 264,71 Kb.
|
| 2.2 Асыл тұқымды малдардың жасырын генетикалық детекциялық ақауларын баламалдау әдістері
Нақты уақыттағы ПТР осы сәтте түзіліп жатқан ПТР өнімін анықтауға мүмкіндік беретін әдіс, яғни, әрбір ПТР циклы өткен сайын оның нәтижесін көруге болады. Өткен жылдарда SNP анықтаудың түрлі әдістері жарыққа шықты, олар аллельдерді дискриминациялаудың түрлі әдістеріне негізделген. Әрбір технологияны түсіну үшін аллельдер дискриминациясы реакциясы мен детекция әдісін бөліп қарау қажет. Аллельдерді дискриминациялау реакциясының өнімдері бірнеше әдіс арқылы детекциялауға болады және сол әдістермен басқа реакциялар мен сынамалар көмегімен алынған өнімдерді детекциялауға болады. SNP-ді идентификациялаудың көптеген әдістерін олардың молекулярлық әсер ету механизміне байланысты 4 топқа бөлуге болады: өзіне тән аллель гибридизация (allele specific hybridization), праймерді аяқтау (primer extension), олигонуклеотидті фрагменттерділигирование жасау(oligonucleotide ligation) және рестриктазалардың көмегімен талдау. Оның өнімдерін анықтаудың және жоғарыдағы келтірілген реакциялардың (флюоресценция, люминесценция және т.б.) әрбір тобын талдау бойынша бірнеше әдістері бар. Real Time PCR арқылы балау жүргізу үшін Applied Biosystems компаниясының келесі реактивтері қажет: секвенирлеуге арналған праймер Sequence Detection Primer 80,0 nmol, фермент Taq DNA Polymerase Recombinant 500 U, генотипирлеуге арналған жиынтық 40 реакцияға арналған, TaqMan Genotyping Master Mix, Mini Pack 40 reactions, Реал Тайм ПЦР балауға арналған праймерлер CVM, 150 реакция (CUSTTQMN SNP ASSAYS NONHUMAN), BLAD балауға арналған РеалТайм ПЦР праймерлері, CUST TQMN SNP ASSAYS NONHUMAN 150 реакциясы [7]. SNPs (от англ. Single Nucleotide Polymorphism) жалпы анықтамасына сәйкес бұл геномды ДНҚ-ының бір нуклеотидті позициясы, олардың популяциясында 1% -дан аз емес сирек аллельдердің жиіліктегі тізбектердің (аллельдердің) түрлі нұсқалары бар. SNPs –дің негізгі артықшылығы оларды детекциялаудың автоматтық әдістерін қолдану мүмкінділігі, мысалы, Real Time PCR SNPs. Нүктелік мутацияларды, BLAD, DUMPS анықтау үшін белгілі SNP скринингілеу кезінде әрбір жағдайда тек белгілі аллельді нұсқаға сәйкес олигонуклеотидтер ғана керек. Флуоресцентті сигналды тіркеу Real Time Step One Plus арнайы амплификаторында амплификациялау үрдісі кезінде жүреді. Амплификаторға жалғанған программалық қамтамасыз ету арқылы флуоресцентті сигналдың интенсивтілігінің көбеюі сайын бастапқы матрицалық ДНҚ концентрациясы анықталады. Бұл тәжірибені жүргізу келесі тәртіппен жүреді: тәжірибе типін анықтау, реагент типін және талдау типін анықтау. CVM нүктелік мутациясын балау үшін Real Time PCR SNPs тәжірибесінде нақты уақыттағы ПТР праймерлерін қолдандық, олар келесі тізбектерден тұрады: F-5'-AGCTGGCACAATTTGTAGGT -3' және R 5'-CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAGC-3', таңбаланған F-VIC 5'-TCATGGCAGTTCTCA-3' және R-FAM 5'-TCATGGCATTTCTCA-3'. BLAD нүктелік мутациясын Real Time PCR SNPs балау үшін нақты уақыттағы ПТР-нің келесі тізбекті праймерлерін қолдандық: F-5'-CAGTTGCGTTCAATGTGACCTT -3' R-5'-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTA-3' және таңбаланған F-VIC 5'-CCCCATCGACCTGTAC-3' және R - FAM 5'-CCCATCGGCCTGTAC-3'. Генотиптеуге арналған праймерлер және VIC, FAM таңбаланған зондтары, праймерлер Applied Biosystems (АҚШ) компаниясымен синтезделген. Бірінші кезекте ДНҚ сынамаларына ТЕ буфер қосу арқылы 20-40 нг/мкл концентрацияға дейін қалыптандырылды. Real-Time PCR компонеттері: TaqMan Genotyping Master Mix (40 × генотиптеуге арналған жиынтық) - 12,5 мкл, тура және кері праймерлер 0,625 мкл, ДНҚ -1,0 мкл, H2O бидистилденген- 10,8 мкл. BLAD Real Time PCR балауды Real Time StepOnePlus амплификаторы көмегімен 25 мкл реакциялық қоспа көлемінде жүргізілді. Эппендорф пробиркасына реакциялық қоспаны 25 мкл компонентін құямыз (15 реакцияға арналған), оның құрамы: TaqMan Genotyping Master Mix 190 мкл, праймерлер 9,5 мкл және бидистилденген су 10,8 мкл. Содан соң вортексте араластырып, реакциялық қоспаны 24 мкл көлемде қосып, 1 мкл-ден 20-40 нг/мкл концентрациядағы ДНҚ-ын қосамыз. Стриптардың ластануының алдын алу үшін латекс қолғаптарын қолдандық. BLAD Real Time PCR балау кезінде бастапқы денатурация 95°C - 10 минут және қалған 40 цикл: I - саты денатурация 95°C - 15 секунд және II – саты праймерлердің жабысуы(отжиг) және элонгация 60°C - 1 минут. Аллельдік тану нақты уақыттағы режимде амплификация графиктерді талдау жолымен жүргізуге болады. Теория түрінде, VIC типті зондттар тек жабайы типке комплементарлы болады және амплификацияның стандартты графигін түзеді, ал FAM зонды тек мутант аллельдерге комплементарлы болады және амплификация графигін түзеді. FAM VIC CD 18 (BLAD) генінің нүктелік мутациясын Real-Time PCR SNPs балау нәтижелерінің графикалық суреті, (FAM зондпен амплификация, мутантты тип, және VIC зондпен, жабайы тип) Сонымен, генотип күшейткіш графиктер арқылы анық анықталынуы мүмкін. Нақты уақыт режиміндегі амплификация графиктері арқылы BLAD бар-жоқтығын зерттеген кезде жабайы типті аллельде әлсіз өзіне тән емес сигнал бақыланды .Бұл нәтиже алдыңғы зерттеулер қорытындысы бойынша анықталынған. Бұл аллельдік өзіне тән зонд басқа аллельмен негіз жұптарымен қате байланысуынан болуы мүмкін; сонымен бірге, SNP учаскелері қасындағы нуклеотидті тізбектер АТ/GC қатты қанықтырылған болса немесе тізбектердің белгілі бір комбинациясынан құралады, ал зонд, әдеттегідей, сәйкес емес аллельдермен салыстырғанда аз айырмашылықтарға ие. VIC FAM BLAD локусы бойынша гомозиготалық дені сау жануарды Real Time PCR балау нәтижелері Оған қарамастан, нақты уақыттағы режимде амплификация графигінің үлгісін жабайы және мутацияланған тип деп оңай бөлуге болады, сондықтан өзіне тән емес сигналдың интенсивтілігі белгіленген жерден біршама төмен болады. CVM Real Time PCR балауды Real Time StepOnePlus амплификаторы көмегімен 25 мкл реакциялық қоспа көлемінде жүргізілді. Эппендорф пробиркасына реакциялық қоспаны құямыз (15 реакцияға арналған), оның құрамы: TaqMan Genotyping Master Mix 190 мкл, праймерлер 9,5 мкл және бидистилденген су 10,8 мкл. Содан соң вортексте араластырып, реакциялық қоспаны 24 мкл көлемде стрипке құйып, 1 мкл-ден ДНҚ-ын қосамыз. Стриптардың ластануының алдын алу үшін латекс қолғаптарын қолданып, стриптің қақпағын ауа өткізбейтіндей етіп ұстағыш көмегімен жабамыз. Нүктелік мутацияны анықтау үшін қажетті рестриктаза жоқ болғандықтан CVM генетикалық дефектін тасымалдаушыны анықтауға ПТР-ПДРФ талдау әдісін қолдану күрделі және қиын болып табылады. CVM тасымалдаушыларын анықтау үшін әдетте полимеразды тізбекті реакциясы әдісінің түрлі нұсқаларын қолданады: аллель-спецификалық праймерлер (AS-PCR) көмегімен геннің бір бөлігін амплификациялау, нүктелік мутацияны анықтау үшін амплификация кезінде рестрикция сайтын жасау (CRS-PCR created restriction site) және эндонуклеазаға арналған сайт рестрикциясын жасау мақсатында бір нуклеотидті алмастыру үшін праймер тізбегін енгізу (PCR-PIRA). Сондықтан, CVM генетикалық дефектін тасымалдаушыларды анықтау үшін Real time PCR SNPs балау әдісі жасалды. Әзірленген Real time PCR SNPs балау әдісі екі сағат ішінде сау гомозиготалық жануарды және гетерозиготалық мутация тасымалдаушысын дәл анықтауға мүмкіндік береді. Сапалы Real Time PCR амплификация жүру үшін денатурация мен праймерлердің жабысуы (отжиг) температурасын оңтайландыру қажет екендігі белгілі. Біздің тәжірибемізде BLAD және CVM Real Time PCR балауда денатурацияға оңтайлы болып 95°С болды және DUMPS Real Time PCR балауда 92°С болды. Real Time StepOnePlus амплификаторының қызметтік мүмкіндіктері алынған нәтижелерді түрлі форматта сақтауға мүмкіндік береді. Ал 58 суретте DUMPS генетикалық дефектіне ДНҚ-ның 15 сынамасын амплификациялау нәтижелерінің және теріс бақылаудың (дистилденген су) графикалық суреті. жүктеу/скачать 264,71 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|