Реферат Тақырыбы : Ірі қара малының blad және сvм тұқым қуалайтын аномалиялары
жүктеу/скачать 264,71 Kb.
|
| ІІ Негізгі бөлім
2.1 Ірі қарат малының BLAD және CVM аутосомалдық аурулары және оларды балау әдістері Мутация лейкоциттердің көптеген дефектілеріне әкеледі. Патогендер енген аймаққа лейкоциттердің миграциясы тежелуінен бұл жасушалар инфекцияны жоюға қатыспайды, нәтижесінде жануарлар инфекцияға төзімсіз болады. CD18 геніндегі мутация нейтрофильдердің қызметін бұзады, олардың капиллярлар эпителийінен және субэпителиальды мембранадан өту қабылеті жоғалады. Сарысу ақзаттарында өзгерістер туындайды (гипоальбуминамия и гиперглобулинонемия) және жіті нейтрофилия байқалады. Ауру жануарлардың қаны лейкоцитарлық құрамы бойынша лейкозға ұқсас болады. Ірі қараның 383 AG, и 775 СТ аймақтарында CD18 генінің кодтаушы бөлігінде екі нүктелік мутация анықталған. Екінші мутация байқалмайды, ал бірінші мутация осы аутосомалды рецессивті аурудың себебі болып табылады. BLAD мутациясын ПТР әдісімен балау үшін мынандай праймерлер пайдаланылады: тура F 5'-AGGCAGTTGCGTTCAATGTGA-3' және кері R 5'-CCGACTCGGTGATGCCATTGA-3' . Полимераздық тізбек реакция жүргізу шарттары: бірінші саты ДНҚ-ны 95°С температурада – 5 минут денатурациялау, екінші саты - 95°С – 45 секунд, праймерлердің жабысуы (отжиг) -620С -45 секунд, элонгация 720С температурада 45 секунд. Аяқтаушы синтез 720С – 5 минутқа созылады. Реакциялық қоспаның мөлшері 50 мкл, құрамында: ПТР-ға арналған 5 мкл 10 Х ПТР буфері, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ тура және кері праймерлер, әр dNTP 5 мкл 0,2 мМ концентрациясы, белсенділігі 5u/μl болатын 0,5 мкл Taq Polymerase ферменті, 5 мкл ДНҚ және 26,5 мкл дистиллденген су. Жұмысқа қажетті концентрацияда праймерлер даярлау. ПТР-ға қажетті праймерлерді Американың Applied Biosystems компаниясы синтездеп, лиофильденген түрде 80 nmol мөлшерде ұсынылады. 80 nmol мөлшерде синтезделген праймерлер бар Эппендорф пробиркасына 800 мкл ТЕ буфер қосады, праймерлер еруі үшін бірнеше секунд шайқайды. Содан кейін, мөлшері 50 мкл аликвоталар даярлайды, олардың біреуін ТЕ буфермен төрт еселейді (яғни, 50 мкл –ге 150 мкл ТЕ буферін қосады). Праймерлердің жұмысқа қажетті концентрациясы 25 мкМ. Концентрациясы 100 мкМ праймерлердің аликвотасы 200С температурада сақтау қажет. Жұмысқа қажетті концентрациядағы праймерлерді 40С температурада бір ай сақтауға болады. Амплификацияға қажетті dNTP қоспасын даярлау. A, G, C және T дезоксирибонуклеозидүшфосфаты 100 мМ ерітінді күйінде 1,0 мл мөлшерде Thermo Scientific компаниясынан алынды. Алдымен барлық төрт dNTP қосу керек, әр праймердің концентрациясы 25 мМ болады. Содан кейін, dNTP-ның 25 мМ аликвотын даярлап, оларды мұздатылған күйінде сақтау керек. ДНҚ-ның қажетті фрагментін амплификациялау үшін, Германияда жасалынған Эппендорф амплификаторы пайдаланылды. Амплификация нәтижесін электрофорез арқылы бромды этидиймен боялған 4% агарозада тексереді. Көлемі 159 ж.н. болатын фрагменттерді анықтау, амплификацияның сәтті жүргенін көрсетеді. Амплификатты рестрикциялау TaqI көмегімен 650С температурада 1,5 сағат жүргізіледі. Рестрикция өнімін электрофорезге мынандай режимде жүргізеді: кернеуі 180 В, тоқтың күші 150 мА, қуаты 50 Вт және ұзақтығы 45-60 минут. Рестриктаза TaqI рестрикция сайты TCGA, фрагменттің ұзындығы 49, 110 және 159 ж.н. норма: 49 + 110, гетерозигота: 49+110+159 ж.н. Электрофореграммада көрсетілгендей (25 сурет), 7-ұяшық ДНҚ маркер, 6-ұяшық концентрациясы 1,0 мМ MgCl2, 5–ұяшық концентрациясы 1,5 мМ MgCl2, 4–ұяшық концентрациясы 2,5 мМ MgCl2, 3-ұяшық 4,0 мМ MgCl2, 2-ұяшық 5,0 мМ MgCl2, 1-және ұяшық 10хПЦР буфер ретінде аммоний сульфатының буфері қолданылды. Концентрациясы 1,5 мМ MgCl2 реакциялық қоспасында амплификация сәтті жүрді және праймерлердің жабысуы (отжиг) кезінде 620С температура қолайлы болды. Амплификация нәтижесі мен рестрикция өнімін визуальдау гель құжаттаушы жүйемен іске асырылды. Дені сау жануарларда Taq I рестриктазасының рестрикция сайты пайда болады және амплификат рестрикциядан кейін 110 ж.н. және 49 ж.н. көлемді фрагменттерге бөлінеді. Амплификат өнімін рестрикциялау рестрикция хаттамасына сәйкес жүргізіледі, 5-кестеде көрсетілгендей 65 0С температурада 2 сағат жүргізілді. Амплификация ұзақтығы 35-40 циклдан тұрды, амплификация аяқталғаннан соң 3% агарозды гель даярлайды. Агарозды гельдің әрбір ұяшығына 7 мкл амплификаттан құйып, бірінші ұяшықа ДНҚ маркері ретінде MspI рестриктазасымен рестрицияланған pUC19DNA пайдаланылады. Генотиптеу нәтижесі бойынша гетерезиготалы BLAD мутациясын тасымалдаушы герефорд тұқымдас Winston аталық бұқасы екені анықталды. Гетерезиготалы жануарлар рестрикциясынан кейін 49 ж.н., 110 ж.н.және 159 ж.н. фрагменттері болады. Асыл тұқымды жануарлардың мутациясын нүктелік детекциялау амплификация өнімін РФҰП талдауы негізінде жүргізіледі. Бір жағдайда нүктелік детекция кезінде белгілі бір нуклеазаның рестрикция сайты жоғалады, басқа жағдайда керісінше, рестриктазаға қажетті рестриктаза сайты пайда болады. Молекулярлық-генетикалық диагностиканың келесі сатысы амплификатты рестрикциялау болып табылады. ДНҚ-ны рестрикциялау (кесу) рестриктаза көмегімен іске асырылады, рестриктаза бактериалды эндонуклеаза тобына жатады. Ірі қара малында омыртқасының кешенді ақауын, CVM, (complex vertebral malformation) алғаш рет 2001 жылы зерттеуші Agerholm J.S. леталды аутосомалды рецессивті тұқым қуалаушы ауру ретінде сипаттап жазды. CVM (Complex Vertebral Malformation) омыртқа жотасының дамуының бұзылуы, ірі қараларда леталды рецессивті мутация болып табылады, ол бұзаулардың өлі туылуымен, буаз сиырлардың іш тастауымен, төлдің мойын және көкірек омыртқаларының қысқа болуымен сипатталады. Тұқым қуалаушы CVM ауруында 559 позициядағы SLC35A3 генінің G/T мутациясы зерттелді. UDP N acetilglucosamine transporter синтезін кодтаушы SLC35A3 гені 3 хромосомада орналасқан, геннің ұзындығы 58582 ж.н. бұл мутация нәтижесінде 180 позициядағы пептид құрамындағы аминқышқылдар валин мен фенилаланинмен алмастырылған. Осы зерттеулер негізінде Жапон зерттеушілері ірі қара малында CVM мутациясын анықтау үшін праймерлер жасап шығарған. Ғылымда бүгінгі күні асыл тұқымды жануарлардың мутациясын нүктелі детекциялау әдістері қолданыста пайдаға асып келеді. Қытай зерттеушілері SLC35A3 генінің мутациясын балау үшін, RsaI эндонуклеазаға рестрикция сайтын жасау арқылы CRS-PCR (created restriction site) әдісін құрастырды. Зерттеушілер SLC35A3 генінің қажетті фрагментін амплификациялау үшін келесі жұп праймерлерін қолданды: тура F5ꞌ-GCTCTCCTCTGTAATCCCCA-3ꞌ және кері R5ꞌ-CCACTGGAAAAACTAGCTGTGAGTA-3ꞌ, праймер құрамына RsaI рестриктазаға қажетті рестриктаза сайты бар. Жапон зерттеушілері CVM тасымалдаушы жануарларды анықтау үшін PCR-PIRA әдісін қолданды, осы әдіске сәйкес нүктелік мутацияны анықтау үшін праймерлер құрамындағы екі нуклеотидті ауыстырған, нәтижесінде PstI және EcoT22 эндонуклеазалары үшін рестрикция сайты пайда болды. Әдетте, (AS-PCR) аллелспецификалық полимераздық тізбек реакцияны қолдану арнайы типті Taq Polymerase ферментін қолдануды және амплификацияға қолайлы жағдайды әрі қарай зерттеу күн сайын таңдауды қажет етеді. Зерттеушілердің деректері бойынша PCR-PIRA қолдану аз уақыт ішіндежануарларда CVM мутациясының барын анықтау үшін генотиптеу жүргізуге мүмкіндік береді. Америкалық зерттеушілер SLC35A3 генінің 559 позициясындағы G/T мутациясын зерттеді, осы зерттеулер негізінде Жапон ғалымдары ірі қара малында CVM мутациясын анықтау үшін праймерлер құрастырды. РФҰП әдісі ПТР өнімдерін талдау үшін қолданылады. G-ді (жабайы типті аллелдер) T (CVM аллель) ауыстырылған мына праймерлерді қолданған кезде PstI рестриктазаға қажетті сайт жоғалады: F 5ꞌ - CAC AAT TTG TAG GTC TCA CTG CA -3ꞌ, R 5ꞌ -CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG -3ꞌ. Ал, F 5ꞌ -CAC AAT TTG TAG GTC TCA ATG CA -3ꞌ, , R 5ꞌ - CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG -3ꞌ, праймерлерін қолданған кезде мутантты аллельді анықтайтын EcoT22 рестрикция сайты пайда болады. Бүгінгі күні генетика ғылымы саласында ірі-қараның генетикалық кемтарлықтарының молекулярлық-генетикалық негіздері жақсы зерттелінген, осы зерттеулер негізінде тұқым қуалаушы ауруларды балау әдістері өндіріске ұсынылған. Ірі қараның генетикалық кемтарлықтары және олардың сипаттамасы
Біз зерттеген локус бойынша, геннің орналасқан жері, сәйкес пептидті синтездеуді кодтау, гендердің параметрлері, нүктелік мутация қайда және қай позицияда болғаны т.б. жағдайлар белгілі болды. жүктеу/скачать 264,71 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||