Глава 3. Инициация репликации

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
19
 
3.1 Инициация репликации у E.coli
 
Инициация репликации в оriС в системе in vitro начинается с формирования комплекса,
в состав которого входят шесть белков: DnaА, DnaВ, DnaС, НU, Girase и SSВ. Сначала с девя-
тичленной последовательностью связывается мономер DnaА, затем 20–40 мономеров этого
белка формируют большой агрегат. ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединя-
ются в области трех тринадцатичленных последовательностей. На следующем этапе димер
DnaВ/DпаС присоединяется к комплексу oriС/DnaА, формируя агрегат размером около 480
кДа, соответствующий сфере с радиусом 6 нм. В результате формируется вилка репликации.

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
20
 
3.2. Инициация репликации у эукариот
 
Инициация репликации ДНК эукариот начинается с образования комплекса ориджина
репликации и белка-инициатора репликации. Этот комплекс называется пострепликативным
(роst.-RС). Он служит платформой для сборки структур более высокого порядка, которые
переводят хроматин в состояние, компетентное для репликации. Последовательные стадии
образования комплексов инициации репликации показаны на рис. 7.
Белком-инициатором репликации ДНК в клетках эукариот является ОRС (origin
recognition complex), который впервые был описан у S.cerevisiae. Впоследствии ORC-подоб-
ные белки были обнаружены и изучены и у других представителей эукариот, а также у мле-
копитающих и человека. У всех эукариот ОRС образован шестью субъединицами – Огс1-
Огсб (120-50 кДа). Для жизнедеятельности S. cerevisiae существенны все шесть субъединиц
комплекса. Две разные группы субъединиц ОRС участвуют в распознавании последователь-
ностей ориджина при его связывании с ориджином репликации. Огс1, Огс2 и Огс4 взаимо-
действуют с АСS, остальные три субъединицы распознают B1– подобные элементы. Воз-
можно, что связь с нуклеотидными последовательностями В1 осуществляет только Огс5.
ОRС специфически связывается с ДНК только в присутствии АТР и обладает АТР-азной
активностью, которая регулируется координированным взаимодействием белка с АТР и эле-
ментами АRS. АТР связывается с субъединицей Огс1 и играет роль кофактора, необходи-
мого для присоединения ОRС к ориджину. Специфическая последовательность ориджина,
связавшегося с ОRС, ингибирует АТРазную активность Огс1, в то время как однонитевые
участки ДНК, появляющиеся в S-фазе, ее снова активируют. При этом меняется конформа-
ция ОRС – с вытянутой (ехtended) на изогнутую (bеnt). Возможно, связывание и гидролиз
АТР субъединицей Огс1 участвуют в контролировании функций ОRС в клеточном цикле.
У делящихся дрожжей S.ротbe белок Огс4 содержит в N-концевом домене так назы-
ваемые «АТ-крючки», с помощью которых ОRС связывается с несколькими областями
АRS1, богатыми АТ-последовательностями. У S.cerevisiae ORS присоединяется к ориджину
в конце митоза, образуя пострепликативный комплекс (post-RС), и остается связанным с ним
в последующих клеточных циклах. При этом post-RС существует в фазах S, G2 и М, а в фазе
G1 входит в состав пререпликативного комплекса (рге-RС).
Пререпликативный комплекс формируется на основе post-RC, этот процесс начинается
во всех ориджинах одновременно на границе фаз М и G1 и завершается в конце G1 в ориджи-
нах, активирующихся первыми при переходе в S-фазу. В ориджинах, активирующихся позже
в S-фазе, образование рге-RC завершается в соответствующий для каждого из них период S-
фазы. В G1-фазе во время сборки рге-RС ОRС способен взаимодействовать с циклинзави-
симыми киназами (Сdks, cyclin-dependent kinases). Это взаимодействие является одним из
механизмов, позволяющих клетке формировать рге-RC после митоза. Первыми к post-RC на
границе фаз М/G1 присоединяются белок Сdс6 (cell division cycle protein) и семейство шести
белков Мст 2–7 (minichromosome maintenance proteins). Белки Мст 2–7 являются наиболее
известными среди семейства «поддерживающих мини-хромосомы» белков, впервые иден-
тифицированных у S.сerevisiae при исследовании мутантов, не способных к поддержанию
стабильности мини-хромосом.

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
21
Рис. 7. Схема инициации репликации у эукариот
Белки Сdс6 и Мст 2–7 описаны у многих представителей эукариот, включая млекопи-
тающих. Недавно было показано, что в клетках S.ротbе и высших эукариот в ранней стадии
формирования рге-RС участвует еще один белок – Cdt1 (cell division termination). Белки Мст
2–7 образуют гексамерный комплекс МСМ – ключевой компонент рге-RС. МСМ генерирует
контрольный сигнал на нереплицированном хроматине для ингибирования преждевремен-
ного митоза в G1-фазе. Также он необходим для продвижения клетки по циклу в S-фазу.
Присоединение МСМ к ориджину репликации регулируется фосфорилированием-дефосфо-
рилированием отдельных субъединиц этого комплекса. Например, частичное дефосфори-
лирование Мст4-субъелиницы, гиперфосфорилированной в фазе М, способствует образо-
ванию рге-RС, а полное дефосфорилирование Мст3-субъединицы инактивирует комплекс
и препятствует его связыванию с хроматином. В то же время, присоединение МСМ к ори-
джину зависит от белков Сdс6 и Сdt1, которые совместно «насаживают» МСМ на хроматин.
В отсутствие Сdс6 клетки S.cerevisiae теряют способность инициировать репликацию ДНК
и подвергаются «урезанному» митозу и нереплицированные хромосомы сегрегируют слу-
чайным образом к полюсам веретена.

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
22
Способность Сdс6 предотвращать «урезанный» митоз до завершения репликации ДНК
обеспечивается его взаимодействием с Cdks. Активность Сdс6 в фазе G1 регулируется также
его взаимодействием с АТР, так как мутации в консервативных последовательностях АТР-
связываюшего мотива Сdс6 приводили к потере способности хроматина присоединять МСМ
в клетках S.cerevisiae и к подавлению репликации ДНК в клетках человека. У S.cerevisiae
в присоединении МСМ к рге-RС принимает участие еще один белок – Mcm10, который
ассоциирован с хроматином и взаимодействует с компонентами Мст2-7. Столь сложный
кнтроль связывания МСМ с ориджином свидетельствует о том, что в клетке существует мно-
гоступенчатая система регуляторных механизмов, необходимая для недопущения повтор-
ного митоза при нереплицированном хроматине. Связывание МСМ с ориджинами репли-
кации необходимо для обеспечения стабильности генома, именно оно переводит хроматин
|в состояние, за которым закрепилось название «разрешающего» репликацию (replication-
liscensing). У кеенопуса для связывания МCM требуется наличие дополнительного фактора,
носящего такое же название, RLF-B (герlication licensing factor B). Белки МCM обнаружи-
вают аффинность к гистонам, а не к ДНК, в результате чего в конце G1-фазы весь прере-
пликативный комплекс прочно привязывается к хроматину непосредственно в участке ори-
джина репликации или рядом с ним.
В G1-фазе к частично сформированному рге-RC присоединяется киназа Сdc7 со своей
регуляторной субъединицей Dbf4 (DNA binding factor 4), а в поздней G1-фазе или на границе
фаз G1/S – белок Сdс45 и связывающий однонитевую ДНК репликативный белок А (RРA,
replication protein A). Взаимодействие между Сdс45 и Dbf4/Cdc7 в поздней G1-фазе требу-
ется для последующего «включения» репликации в ориджинах после сборки рге-RС.
Киназа Dbf4/Cdc7 связывается с ori за некоторое время до того, как начинает выполнять
свои функции. Присоединившись к рге-RС, киназа Dbf4/Cdc7 «ждет», когда активируются
Сdk, и только после этого фосфорилирует свои субстраты. Роль «раннего» связывания этой
киназы с ori пока остается неясной.
Связывание Сdс45 с хроматином зависит от белков Сdс6 и Мст2 и от активности
киназы Dbf4/Cdc7 и циклинзависимых киназ S-фазы (Cdk-S-фазы – Сdс28/Сkb5,6 у дрожжей
и Сdk2/Сусlins А,Е у высших эукариот). Белок Сdc45 может быть фосфорилирован кина-
зой Dbf4/Cdc7, но это происходит только после активации Cdk-S-фазы. Активность Cdk-
S в свою очередь регулируется ингибитором Sic1, который в конце фазы G1 подвергается
убиквитинзависимому протеолизу. Присоединение белка Сdс45 к рге-RС происходит в позд-
ней G1-фазе клеточного цикла только на ориджинах тех репликонов, которые начинают син-
тез ДНК первыми при переходе к S-фазе. Cdk-S и Dbf4/Cdc7-зависимое связывание Cdc45
с остальными ориджинами осуществляется в определенное для каждого из них время на
протяжении всей S-фазы. Вероятный механизм присоединения Сdс45 к рге-RС таков: Dbf4/
Cdc7, связавшаяся со всеми ориджинами репликации в фазе G1, после воздействия Cdk-S
фосфорилирует Мст2 в каждом ориджине в тот период фазы S, который определяется инди-
видуально для каждого ориджина. В результате фосфорилирования Мст2 конформация ком-
плекса МСМ меняется таким образом, что он приобретает способность связывать Сdс45. В
то же самое время к рге-RС присоединяется белок RРА. Подобно Сdс45 RРА связывается с
ориджином Cdk-S зависимым образом при участии Мст2. Присоединение белков Сdс45 и
RРА завершает сборку рге-RС. Сразу после завершения сборки рге-RС происходит частич-
ная его диссоциация, сопровождающаяся началом формирования RС (replication complex).
Белок Сdc6 первым диссоциирует из рге-RС при переходе из фазы G1 в S или даже ранее,
подвергаясь фосфорилированию под действием Сdks, за которым следуют убиквитиниро-
вание и деградация. Этот путь инактивации Сdс6 показан как для низших эукариот, так и
для некоторых представителей высших эукариот. В клетках человека уровень Сdc6 оста-
ется постоянным на протяжении всего клеточного цикла. Но при переходе в S-фазу Сdс6

И. М. Спивак. «Репликация ДНК: учебное пособие»
23
транспортируется из ядра в цитоплазму. По всей видимости, и этот процесс регулируется
Сdks. Удаление Сdc6р из ядра (путем гидролиза или транспортировки в цитоплазму) явля-
ется одним из механизмов, предотвращающих множественные акты репликации в течение
одного клеточного цикла.
Белок Сdt1 также инактивируется после завершения формирования рге-RС. При этом в
клетках низших эукариот Cdt1. периодически экспрессируется, накапливаясь в ядрах в фазе
G1, а в фазе G2 его уровень падает. У высших эукариот активность Сdt1 контролируется
белком-ингибитором геминином, который отсутствует в клетках в фазе G1, накапливается
на протяжении фаз S, G2 и частично – фазы М и исчезает в М-фазе на границе метафазы
и анафазы.
В отличие от Сdс6 и Сdt1 белки Мст2-7, RРА и Сdс45, диссоциировав из рге-RС, оста-
ются связанными с хроматином в S-фазе во время синтеза ДНК. Быстрое освобождение
МСМ из рте-RС в клетках дрожжей обеспечивается взаимодействием между Мcm10 и Мст7.
Разъединению МСМ и Мст10 способствует белок Сdс45.
Субъединицы Мст4,6,7 комплекса МСМ обладают геликазной активностью, проявля-
ющейся только при стимуляции под действием Cdk-S и киназы Dbf4/Cdc7. Белки Мст2-7
существенны не только для инициации, но и для элонгационной фазы репликации, для про-
грессии репликативных вилок. МСМ входит в состав RС и принимает участие в раскручи-
вании двунитевой ДНК в репликативных вилках. В клетках человека связывание МСМ с
ориджином при формировании RС осуществляется с участием белка Мcm10, который накап-
ливается и образует комплекс с хроматином в S-фазе, в отличие от Мcm10 S.сегevisiae. При
переходе клеток из фазы G2 в М Мcm10 гиперфосфорилируется и диссоциирует из хро-
матина, а на границе фаз М/G1 он подвергается протеолизу по протеосомному механизму.
Таким образом, фосфорилирование и протеолиз Мcm10 в клетках человека осуществляют
отрицательную регуляцию активности МСМ после завершения репликации ДНК. Кроме
того, отрицательная регуляция активности МСМ может быть результатом непосредствен-
ного фосфорилирования отдельных компонентов самого этого комплекса. Так, например,
фосфорилирование Cdk специфических сайтов Мcm4 в фазе М приводит к потере геликаз-
ной активности Мст4,6,7, а высокая концентрация комплекса Cdk-циклин Е в ядрах эмбри-
онов Хепорus препятствует связыванию Мст3 с ДНК и таким образом предотвращает реас-
социацию МСМ с хроматином после завершения репликации. Комплекс МСМ участвует
не только в ранних этапах инициации репликации при переходе клеток в фазу G1, но и в
завершении этого процесса в фазе S. Причем на завершающем этапе инициации репликации
МСМ выполняет две функции: раскручивает ДНК в ориджине и служит остовом, к которому
присоединяются остальные компоненты при формировании RС. Поэтому множественные
механизмы регуляции активности МСМ вполне объяснимы. Если в фазе G1 эти механизмы
направлены на осуществление продвижения клеток к фазе S без повторного митоза, то в
фазах S и G2 они предотвращают повторную репликацию уже реплицированного хроматина.
RРА является белком, связывающим однонитевую ДНК и наличие его в RС при ини-
циации репликации необходимо для стабилизирования расплетенного участка ДНК. RРА
образован тремя субъединицами с молекулярными массами 70, 34 и 11 кДа, причем активно-
стью, связывающей однонитевую ДНК, обладает субъединица 70 кДа, а субъединица 34 кДа
является регуляторной. Последняя фосфорилируется Сdk, что, по-видимому, необходимо
для активации репликации ДНК. Подробное описание этого комплекса будет дано далее.
Белок Сdс45 также участвует в формировании RС. Он необходим для присоединения
ДНК-полимеразы α к ориджинам репликации. Показано, что белок Сdс45 человека связы-
вается с белком Мст7 человека и субъединицей р70 ДНК-полимеразы α in vitro. Сdс45 при-
соединяет ДНК-полимеразу α к RС посредством связывания с Мст7. В клетках дрожжей

жүктеу/скачать 2,57 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: