С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
Глава 12. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК И ПРЕПАРАТОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 139 центрифугируют 3 мин при 300g и инкубируют при 37ºС в течение 20 мин. Среду отсасывают, по каплям добавляют 50 % раствор полиэтиленгликоля и разводят средой в 5–10 раз. После выдерживания в течение 2–8 ч клетки переносят в лунки планшета на 96-ячеек. Через сутки среду меняют на ГАТ и инкубируют в водонасыщенной атмосфере с содержанием углекислого газа 5 %. Колонии появляются на 10–14 сутки. 5. Селекция гибридных клеток на среде ГАТ – отбор штаммом продуцентов (определение антителообразующей способности гибридом) Клетки в количестве 500 тыс. инкубируют с 0,25 культуральной жидкости, разведенной 1 к 10 0,9 % раствором натрия хлорида, содержащего 0,1 % азида натрия. Инкубируют при 4ºС в течение 30 мин. Затем промывают фосфатным буферным раствором, который содержит 2 % эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 % натрия азида и N-2- гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфоновую кислоту и инкубируют при 4ºС в течение 30 мин с 20 мкл поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена. После чего промывают этим же буфером и ресуспендируют в изотоническом растворе с 1 % формалина. Анализируют флуоресценцию на проточном цитофлуориметре. Отбирают штамм ICO-90. 6. Клонирование Получают фидер (слой поддерживающих клеток) селезенки и тимуса мышей линии BALB/b. Фидер получают путем гомогенизации органов, процеживания через ткань и их помещения в лунки планшета со средой 199 или RPMI. Через 3–7 суток образуемся слой, используемый как фидер. Клетки клона разводят до 50 клеток в 10 мл и помещают в лунки. Видимые колонии возникают через 10–14 дней. 7. Консервирование гибридом Гибридомы в логарифмической фазе извлекают из лунок, выдерживают в среде с 20 % эмбриональной телячьей сыворотки и 50–70 г/л диметилсульфоксида. Клетки сначала выдерживают при 2–4ºС в сосуде Дьюара в течение 1–3 ч и затем переносят в жидкий азот. Затем клетки из банка продуцентов извлекают, предварительно подготавливают и помещают в биореакторы для ферментации. После чего жүктеу/скачать 2,61 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|