С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Технологическая схема получения моноклональных антител
Часть 2. Частные вопросы биотехнологии. Клеточная биотехнология 138 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получать из культуральной жидкости. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток. Создание гибридом, которые можно хранить в замороженном состоянии (криоконсервирование), позволило организовать целые гибридомные банки, что в свою очередь открыло большие перспективы по применению моноклональных АТ. Технологическая схема получения моноклональных антител 1. Выделение Т-лимфоцитов по их розеткообразованию с эритроцитами барана Лейковзвесь выделяют на градиенте плотности фикол-верографин и центрифугируют при комнатной температуре в течение 40 мин при 300g. Мононуклеары отделяют и промывают средой 199. Затем смешивают с эритроцитами барана и эмбриональной телячьей сывороткой. Смесь инкубируют 15 мин при 37ºС, центрифугируют при 150g в течение 5 мин и инкубируют при 4ºС 12–16 ч. Затем проводят осторожно суспендирование клеток и их наслаивание на градиент фикол-верографин и центрифугируют. Розетки осаждаются на дно. При помощи гипотонического раствора их разрушают. Выделенные Т-клетки используют для иммунизации животных. 2. Иммунизация мышей и получение клеток селезенки Иммунизацию мышей линии BALB/b (инбредные мыши, сингенные по отношению (генетически сходные) к плазмоцитоме) проводят путем введения им в хвостовую вену 2000 Т-клеток. Проводят 5 раз с интервалом 2 недели. Последнюю иммунизацию проводят за 4–5 дней до извлечения селезенки. Извлекают селезенку в асептических условиях, гомогенизируют и процеживают через ткань, промывают средой 199 2–3 раза. 3. Подготовка миеломных клеток Клетки мышиной миеломы поддерживают в культуральной среде, содержащей 15 % эмбриональной телячьей сыворотки, глютамин и гентамицин. 4. Слияние клеток, получение гибридом Клетки миеломы мышей и клетки селезенки смешивают в соотношении 1 к 10. Промывают средой 199, помещают в эту же среду, |