8.2 Ферменты, применяемые при конструировании
рекомбинантных ДНК
Большинство
ферментов,
используемых
в
технологии
рекомбинантных ДНК, выделяют из клеток бактерий и используют для
«разрезания» и «сшивания» фрагментов ДНК как прокариотических, так и
эукариотических клеток. Эти ферменты можно разделить на несколько
групп:
ферменты, с помощью которых «вырезают» фрагменты ДНК
(рестриктазы);
ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (ДНК-
полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы, ревертазы);
ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
Глава 8. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ
БИОТЕХНОЛОГИИ
91
ферменты, изменяющие строение концов фрагментов ДНК.
Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) – ферменты, с помощью
которых «вырезают» фрагменты ДНК. Самая первая рестриктаза Eco RI
была выделена из E. сoli. Эти высокоспецифичные ферменты узнают и
расщепляют определенные последовательности азотистых оснований в
молекуле ДНК (сайты рестрикции).
В результате действия рестриктаз, как правило, образуются
фрагменты (рестрикты) ДНК с уступами, т.е. на концах одна цепь длиннее
другой, что образует своеобразный «хвост». Такие концы (хвосты)
получили название «липких» концов, т. к. они способны к
самокомплементарности. В результате рестрикции также могут
образовываться и «тупые» концы (рисунок 8.1).
Рисунок 8.1 – «Разрезание» молекулы ДНК эндонуалеазами рестрикции с образованием
«липких» и «тупых» концов
Обратные транскриптазы, ДНК-полимеразы – ферменты,
синтезирующие ДНК на матрице ДНК. В генной инженерии часто
используется ДНК-полимераза I, выделенная из клеток Е. coli (Pol I).
Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной
массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру.
РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) – это фермент,
который используют для синтеза комплементарной цепи ДНК на базе
мРНК.
Лигазы – ферменты, которые «сшивают» фрагменты ДНК за счет
фосфодиэфирных связей, образующихся между 3'-гидроксильной
|
