С курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров
жүктеу/скачать 2,61 Mb. Pdf көрінісі
|
Часть 3. Частные вопросы биотехнологии. Микробная биотехнология 248 обрабатывают ультразвуком для разрушения клеток. Из надосадочной жидкости rt-PA выделяют при помощи аффинной хроматографии. Затем проводят дополнительную очистку при помощи ионообменной хроматографии. Меланомный и рекомбинантный тканевые активаторы плазминогена фармакологически идентичны. Определение rt-PA проводят иммуноферментным методом, прямым и непрямым функциональным методом. В прямом функциональном методе синтетический хромогенный или флуорогенный специфический субстрат t- PA инкубируют с образцом и измеряют скорость образования продукта гидролиза субстрата под действием rt-PA. В непрямом функциональном методе плазминоген активируют под действием rt-PA в присутствии субстрата плазмина и активность rt-PA определяют по гидролизу субстрата образующимся плазмином. К непрямым функциональным методам, в которых используют природный субстрат плазмина фибрин, относятся методы, основанные на измерении площади зоны лизиса фибриновой пластины или времени полного лизиса фибринового сгустка. Получение урокиназы. Содержится в моче человека в форме двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Различают высоко- и низкомолекулярную формы с ММ 55000 и 34000 соответственно. Вызывает лизис внутри тромба и не вызывает аллергических реакций. Выделяют одноцепочечную форму (проурокиназа), которая состоит из 411 аминокислот. Содержится в плазме крови. Получают из культуры клеток почки эмбриона человека или генной инженерией (используют ген урокиназы, локализованный в 10 хромосоме человека, и E. coli). Продукт содержит одну или две цепи, что зависит от присутствия протеаз при получении. Рекомбинантная урокиназа обладает лучшей тромбоселективностью и меньшим числом побочных эффектов, чем природный фермент. Для получения урокиназы используют первичную культуру почки эмбриона человека. Культивирование проводят на среде 199 или RPMI при температуре 35–37ºС с добавкой сыворотки эмбриона крупного рогатого скота. После формирования сплошного слоя клеток проводят их промывку физиологическим раствором и добавляют консервирующую жидкость (натрий лактальбумин, натрий гидрокарбонат и глюкоза). В консервирующей смеси выдерживают в течение 9 суток. Затем консервирующую жидкость удаляют, добавляют фенилаланин и пополняют новой средой, которую меняют каждые трое суток в течение 10 дней |