Сборник научных трудов по материалам
жүктеу/скачать 3,44 Mb. Pdf көрінісі
|
| Материалом служили образцы крови крс полученные из подхвосто-
вой вены в 20 мл пробирки с ЭДТА, а затем замороженные при температуре - 18°(-20°) С. ДНК из крови выделялась несколькими методами. Первый метод осуществлялся с помощью КИТа (комплекта реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови) фирмы «Синтол». Этот КИТ рекомендован для использования в медицинской практике для выделе- ния небольшого количества ДНК из свежей крови и последующего проведе- ния ПЦР анализа. Перед использованием реактивов из набора, кровь размо- раживали, отбирали в эппендорфы. К 300 мкл крови добавляли 1 мл 0,9% р-ра NаCl, перемешивали, центрифугировали 2,5 krpm 5′, удаляли верхнюю фракцию. Так повторяли 3-4 раза, до светлого оттенка осадка. Далее исполь- зовали реактивы набора, и проводили выделение ДНК согласно инструкции по этапам: 1. Лизис эритроцитов. 2. Лизис ядер клеток. 3. Осаждение ДНК. 4. Промывка и растворение ДНК. 67 На этапе лизиса ядер клеток существует два способа: с использованием фермента и без него. По инструкции рекомендовано после добавления Про- теиназы К прогревать смесь при температуре 60°С 15-20 минут. Опробованы были оба способа. Однако выделенная ДНК была не качественной, имела большой разброс в показателях концентрации (от 15 до 200mg/ml), не опти- мальное соотношение (очистку) по белковым примесям, что определялось с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-2000C при A260/280 нм. Необхо- димо отметить, что замороженная кровь хранилась более одного года. Всего данным методом была выделена ДНК из 100 образцов крови крс, которая при хранении более 3-х месяцев не давала положительных результатов при ам- плификации. Второй метод. Данный метод заключается в промывке биоматериала последовательно в двух буферах, без использования протеиназы К. Один из буферов имеет в составе СТАВ, детергент, разрушающий клеточные мембра- ны и образующий комплексы с клеточными белками и полисахаридами. По- сле отмывки биоматериала в двух буферах, добавляли хлороформ, а затем изопропанол. Полученную ДНК растворяли в деионизированной воде или ТЕ. Протокол данного метода: 1. В эппендорф на 2,0 мл отбираем размороженную кровь 100,0 мкл. 2. Добавляем 400,0 мкл буфера №1. 3. Добавляем 400,0 мкл буфера № 2, помещаем в термостат 60 о С на 30 мин. 4. Добавляем хлороформ 700,0 мкл и ставим в мешалку на 30 мин. 5. Центрифугируем 5 Ꞌ 10krpm, переносим верхнюю фракцию в новый эппендорф. 6. Добавляем 700, 0 мкл изопропанола. 7. Центрифугируем как в п.5, аккуратно сливаем (на дне виден осадок ДНК). 8. Добавляем по 150,0 мкл 80% этанола, сливаем осторожно (можно использовать механические пипетки или вакуумный отсасыватель) . 9. Сушим (на дне эппендорфа видна ДНК) при комнатной температу- ре до испарения спирта. 10. Добавляем по 100,0 мкл ТЕ или деионизированной воды. Буфер № 1: 10 мл 1М Tris-HCl pH 8.0, 4 мл 0,5М EDTA pH 8.0, 28 мл 5М NaCl, в 50,0 мл дистиллированной воды [2]. Буфер № 2: 2 г СТАВ, 50,0 мл дистиллированной воды. Этим методом было выделено 200 проб крови крс. Кровь была двух ви- дов: хранившаяся более года и свежезамороженная. ДНК проверялась на ага- розном геле после электрофореза (наблюдалось яркое равномерное свечение всех образцов), а также после ПЦР в режиме реального времени с праймера- ми, подобранными для исследования гена CDGAT1 (все образцы ДНК разго- рались после 15-20 цикла). Для оценки качества полученной ДНК NanoDrop ND-2000C не использовали, так как полученные результаты после проведе- 68 ния ПЦР были решающими, а оценка на спектрофотометрах не всегда оправ- дана [3]. Третий метод описан на сайте http:molbiol.ru [1] с использованием Протеиназы К и SDS 10%, ацетата натрия (3М СН 3 СОONa Рн 7,5) и экстра- гировали нейтральным Ф:Х (фенол:хлороформ). Состав буферов несколько другой, он также описан на сайте. Четвертый метод получен в результате модификации третьего мето- да. После добавления протеиназы К и SDS 10% смесь инкубировали в термо- стате при t=57 о C 3 ч, вместо смеси Ф:Х использовали только хлороформ. ДНК осаждали двумя способами: используя NaCl и 96% этанол или ацетат натрия (3М СН 3 СОONa) и изопропанол. Далее по протоколу [1]. Эти вариан- ты требовали большего количества времени и реактивов, что является не эф- фективным при выделении ДНК из большого количества проб. При использовании каждого метода были опробованы различные мо- дификации этапов. Однако второй метод оказался наиболее эффективным, быстрым и экономичным для используемого материала (замороженной крови крс). жүктеу/скачать 3,44 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|