Сборник научных трудов по материалам



Pdf көрінісі
бет46/107
Дата19.12.2022
өлшемі3,44 Mb.
#58265
түріСборник
1   ...   42   43   44   45   46   47   48   49   ...   107
Байланысты:
Sb k-4-2

Материалом служили образцы крови крс полученные из подхвосто-
вой вены в 20 мл пробирки с ЭДТА, а затем замороженные при температуре -
18°(-20°) С. ДНК из крови выделялась несколькими методами.
Первый метод осуществлялся с помощью КИТа (комплекта реагентов 
для выделения геномной ДНК из цельной крови) фирмы «Синтол». Этот 
КИТ рекомендован для использования в медицинской практике для выделе-
ния небольшого количества ДНК из свежей крови и последующего проведе-
ния ПЦР анализа. Перед использованием реактивов из набора, кровь размо-
раживали, отбирали в эппендорфы. К 300 мкл крови добавляли 1 мл 0,9%
р-ра NаCl, перемешивали, центрифугировали 2,5 krpm 5′, удаляли верхнюю 
фракцию. Так повторяли 3-4 раза, до светлого оттенка осадка. Далее исполь-
зовали реактивы набора, и проводили выделение ДНК согласно инструкции 
по этапам:
1. Лизис эритроцитов. 2. Лизис ядер клеток. 3. Осаждение ДНК.
4. Промывка и растворение ДНК.


67 
На этапе лизиса ядер клеток существует два способа: с использованием 
фермента и без него. По инструкции рекомендовано после добавления Про-
теиназы К прогревать смесь при температуре 60°С 15-20 минут. Опробованы 
были оба способа. Однако выделенная ДНК была не качественной, имела 
большой разброс в показателях концентрации (от 15 до 200mg/ml), не опти-
мальное соотношение (очистку) по белковым примесям, что определялось с 
помощью спектрофотометра NanoDrop ND-2000C
при A260/280 нм. Необхо-
димо отметить, что замороженная кровь хранилась более одного года. Всего 
данным методом была выделена ДНК из 100 образцов крови крс, которая при 
хранении более 3-х месяцев не давала положительных результатов при ам-
плификации.
Второй метод. Данный метод заключается в промывке биоматериала 
последовательно в двух буферах, без использования протеиназы К. Один из 
буферов имеет в составе СТАВ, детергент, разрушающий клеточные мембра-
ны и образующий комплексы с клеточными белками и полисахаридами. По-
сле отмывки биоматериала в двух буферах, добавляли хлороформ, а затем 
изопропанол. Полученную ДНК растворяли в деионизированной воде
или ТЕ.
Протокол данного метода: 
1. В эппендорф на 2,0 мл отбираем размороженную кровь 100,0 мкл. 
2. Добавляем 400,0 мкл буфера №1. 
3. Добавляем 400,0 мкл буфера № 2, помещаем в термостат 60
о
С на 
30 мин. 
4. Добавляем хлороформ 700,0 мкл и ставим в мешалку на 30 мин. 
5. Центрифугируем 5

10krpm, переносим верхнюю фракцию в новый 
эппендорф. 
6. Добавляем 700, 0 мкл изопропанола. 
7. Центрифугируем как в п.5, аккуратно сливаем (на дне виден осадок 
ДНК). 
8. Добавляем по 150,0 мкл 80% этанола, сливаем осторожно (можно 
использовать механические пипетки или вакуумный отсасыватель) . 
9. Сушим (на дне эппендорфа видна ДНК) при комнатной температу-
ре до испарения спирта. 
10. Добавляем по 100,0 мкл ТЕ или деионизированной воды. 
Буфер № 1: 10 мл 1М Tris-HCl pH 8.0, 4 мл 0,5М EDTA pH 8.0, 28 мл 
5М NaCl, в 50,0 мл дистиллированной воды [2]. 
Буфер № 2: 2 г СТАВ, 50,0 мл дистиллированной воды.
Этим методом было выделено 200 проб крови крс. Кровь была двух ви-
дов: хранившаяся более года и свежезамороженная. ДНК проверялась на ага-
розном геле после электрофореза (наблюдалось яркое равномерное свечение 
всех образцов), а также после ПЦР в режиме реального времени с праймера-
ми, подобранными для исследования гена CDGAT1 (все образцы ДНК разго-
рались после 15-20 цикла). Для оценки качества полученной ДНК NanoDrop 
ND-2000C
не использовали, так как полученные результаты после проведе-


68 
ния ПЦР были решающими, а оценка на спектрофотометрах не всегда оправ-
дана [3]. 
Третий метод описан на сайте http:molbiol.ru [1] с использованием 
Протеиназы К и SDS 10%, ацетата натрия (3М СН
3
СОONa Рн 7,5) и экстра-
гировали нейтральным Ф:Х (фенол:хлороформ). Состав буферов несколько 
другой, он также описан на сайте.
Четвертый метод получен в результате модификации третьего мето-
да. После добавления протеиназы К и SDS 10% смесь инкубировали в термо-
стате при t=57
о
C 3 ч, вместо смеси Ф:Х использовали только хлороформ. 
ДНК осаждали двумя способами: используя NaCl и 96% этанол или ацетат 
натрия (3М СН
3
СОONa) и изопропанол. Далее по протоколу [1]. Эти вариан-
ты требовали большего количества времени и реактивов, что является не эф-
фективным при выделении ДНК из большого количества проб.
При использовании каждого метода были опробованы различные мо-
дификации этапов. Однако второй метод оказался наиболее эффективным, 
быстрым и экономичным для используемого материала (замороженной крови 
крс).


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   42   43   44   45   46   47   48   49   ...   107




©emirsaba.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет