Тақырыбы: Ғылыми зерттеулерді ұйымдастыру

19 
Қалындығы 5-10 мкм кесіндіні арнаулы қүрал микротом арқылы дайындайды. Сапалы бекіткіш 
объектінің тірі күйіндегі күрлымьш көп өзгертпейді. Бекіткіш үлпаны тығыздайды және автолиз 
процестерін токтатады. Кейбір бекіткіш сүйықтар белгілі күрылымдардын бояулармен боялу 
қабілетін арттырады. Жиі қолданылатьш бекіткіштер: формальдегид, қосхромдық қышқыл калий, 
сірке, пикрин және осмий қышқылдары мен этил спирті. Жақсы бекіткіш сүйықтардың қоспалары 
көпшілігі оларды үсьшған зерттеушілердің аттарымен аталған (Буэнің, Карнуаның қоспалары). 
Бекіткеннен кейін объектіні үлпаға сіңетін ортаға батырады (мысалы, целлоидин немесе парафин). 
Осы тығыздаушы заттар жаксы сіңу үшін үлпанын бөлшегінен этил спиртінін көмегімен суды 
ығыстырып шығарады, содан кейін кислолға немесе толуолға салады. Алдьш-ала істелетін бұл екі 
кезең үлпаға парафин сіңу үшін қажет. Жылы сұйық парафин үлпаға сіңеді де, қатып калады. 
Микротомнын көмегімен парафин блогынан шыныға бекитін жүқа кесінділер дайындалады. 
Кесінділерден парафинді ксилолдың көмегімен шығарады. Осыдан кейін кесіндіні бояиды. 
Көбінесе ұлпаны гематоксилинмен және эозинмен бояиды. Гематоксилинмен боялатын 
құрылымдар-ды базофильдік деп атайды. Эозинкышқыл бояу байланыстыратьш клетканың 
компоненттерін ацидофильдік немесе эозинфильдік дейді. Бүл күрылымдарды тірі клеткада бел-
сенділік күйінде көру үшін әр түрлі микроскоптар шығарылған: фаза-контрастық, поляризациялық, 
флуоресценттік, тағы басқалары. Бұл микроскоптардың бәрі жарықты пайдалануға негізделген. 
Соңғы 
кезде 
электрондык 
микроскоп 
та 
кен 
қолданылып 
жүр.
Электронды микроскопты 1931 жылы Девиссон мен Калбек Германияда шығарған. Клетканың 
біршама анық көрішсін Руска мен Кнолль 1934 жылы алған болатын. 1950 жылы алғаш рет 
ультражұқа кесінділер алынған. Электронды микроскопқа препарат дайындайтын қүралды 
ультрамикротом деп атайды. Электронды микроскоптың көрсету мүмкіндігі өте жоғары. 
Электронды микроскоп жа-рық микроскопына қарағанда клетканы 100000 есе артық үлкейтеді. 
Қазіргі электронды микроскоптың керсеткіштік мүмкіндігі 0,1-0,3 нм-ге дейін жетеді. Клетканың 
барлық ультрақұрылысын молекулалық деңгейде зерттеуге мүмкіншілік береді. Электронды 
микроскопта жарық сәулесінің орнында электрондар ағысы қолданылады. Жа-рық 
микроскопындағы объектив пен окулярдың ролін электронды микроскопта электромагниттік 
линзалар 
атқарады. 
Сөйтіп 
объектішң 
бейнесі 
экранға 
түседі.
Электронды микроскоппен зерттеу үшін үлпалар бөліктерін негізінде жарық микроскопымен 
зерттегендей өңдеуден өткізеді. Бекітуді ерекше ұқыптылықпен жүргізу керек, себебі 
макромолекулалық деңгейге дейінгі клетканың құрылысын сақтау қажет. Көбінесе екі рет бекітуден 
өткізеді — алдымен глутаральдегидте немесе формальдегидте. Кейін осмий ангидритының 
ерітіндісінде бекітеді. Сіңіру ортасы ретінде жасанды смола, аралдит немесе эпон қолданылады. 
Қалыңдығы 50-100 нм кесіндіні әйнек пышақтармен дайындайды. Радиоавтография әдісі метабо-
лизмдік 
процестердің 
динамикасын 
зерттеуге 
мүмкіншілік 
береді.
Радиоактивтік изотоптармен танбалаған молекулалар-ды, мысалы фосфордын Р32, кеміртегінің С14 
және сутегінің — тритий Н3, изотоптарын организмге енгізеді. Сіңген ра-диоактивтік молекулалар 
клетканың белгілі бөліктерімен химиялық реакцияға түседі, ал олардың бар, жоқтығы мен орньш 
радиоавтография тәсілімен анықтайды. Қүрамында радиоактивтік зат бар парафинді кесінділерді 
фотоэмульси-ямен жауып, бірнеше күн қараңғыда үстайды. Радиоактивтік ыдырау үлпаның изотоп 
бар жерінің қараюына әкеліп соғады. Гистологиялық қүрылымдарды зерттейтін сапалық талдау 
тәсілдерінің ішінде кең тарағаны цито- және гистохимиялық әдістер. Бүл әдістердің негізінде 
клеткалардың, үлпалар мен органдардың қүрылымында химиялык заттардың таралуын анықтау 
мақсатында химиялық реакциялар-ды пайдалану жатады. Қазіргі гистохимиялык әдістер 
құрылымдардағы амин қышқылдарын, белоктарды, нуклеин қышқылдарын, көмірсуларды, 
липидтерді байқауға және ферменттердің белсенділігін анықтауға мүмкіншілік береді.
Гистохимиялық әдістер мүздатылған кесінділерді бояу кезінде жиі қолданылады, бірақ та 
парафинді кесінділерді де пайдалавуға болады. Соңғы жылдары гистохимиялық тәсілдерді 

20 
электронды микроскопиялық әдіспен бірге жүргізу, болашағы мол жаңа бағыттың — электронды 
гистохимияның дамуьша әкеліп соқты. Қазіргі кезде сапалық тәсілдермен бірге үлпалар мен 
клеткалардағы түрлі заттардың мөлшерін анықтайтын сандық гистохимиялық әдістер қолданылып 
жүр.
Липидтерді зерттеген кезде бекітілген үлпаны парафиндеуге болмайды, себебі спирттер арқылы 
өткізген кезде липидтер ериді. Сондықтан оны криостатта мүздатылған күйінде кесу керек. Этил 
спиртінде сусыздандыру үлпаның көлемін кемітеді. Суды лиофилизация (мүздатылған күйінде 
кептіру) тәсілімен жоюға болады. ұлпаны тез мүздатады (мысалы сүйық азотпен), содан кейін 
төменгі температурада вакуумде сусыздандырады. Лиофилизацияланған үлпаның бөлігін 
формальдегид 
буында 
бекітеді 
де 
парафинге 
салады.
Биологиялық жүйелердің қүрылысы мен функциясы жөніндегі толық мәліметтерді алу үшін 
қүрылымдарды тірі күйінде зерттеу керек. Үлпалардың колдан өсіріп зерттеуді организмнен тыс 
(in vitrum) (латынның әйнек деген сөзі) және организмнің өзінің қүрамында (in vivo) жүргізуге 
болады. Ұлпаларды іп vitro жағдайында қолдан өсіру тәсілінде клеткалар мен үлпалардың стерилдік 
жағдайда арнаулы қоректік ортада шыны камераларда (организмнен тыс) өсіреді. Бүл кезде 
клеткалар тірі клеткалардын негізгі қасиеттерін үзақ уақыт (он жылға дейін, тіпті онан да көп) 
сақтайды. Тірі клеткаларды кинопленкаға түсіріп алуға да болады. Тірі клеткаларды зерттеген кезде 
микрохирургия әдісін де қолданады. Микроманипуляртор деп аталатын қүралмен клетканы кеседі, 
ішінен бөліктерін шығарып алады. Операцияның барысын микроскоп арқылы байқайды. Микрохи-
рургиялық құралдар - өте кішкентай шыны қармақтар, инелер, капиллярлар. Микроманипуляцияны 
арнаулы камераларда жүргізеді. Рентгенструктуралық талдау әдісі рентген сәулелерінің дифракция 
құбылысына негізделген цитоплазма мен ядроның құрамына кіретін белоктардың, нуклеин 
кышқьглдарының және басқа заттар молекулаларының құрылысын зерттеу үшін қолданады. Бүл 
тәсіл молекулалардың кеңістіктегі орналасуын аныктауға, олардың ара қашықтықтарын өлшеуге 
мүмкіншілік береді. 
Дәріс 5
Микроскопиялық эксперименттік зерттеу әдістері 
Мақсаты Микроскопиялық эксперименттік зерттеу әдістері ерекшеліктері және қолданылуын 
талдау. 
Мәселелері:
3. Клетканың жалпы морфологиясын зерттеу әдістерін жіктеу. 
4. Микроскоптардын қолданылуы
Цитололгияда негізгі қолданылатын әдістердің бірі-жарық микроскопы. Соңғы жылдары 
жасушаны зерттеуде жарық микроскоптарының бірнеше түрлерін қолданылып жүр 
(люминесценттік, фазасы қарама-қарсы, электронды микроскоптарды). Жарық микроскоптарының 
көмегімен ұлпадан алынған және әр түрлі бояулармен боялған жұқа кесінділерді (препарат) 
зерттеуге болады. Ол үшін кесіндінің қалыңдығы 5—7 микроннан (мк) аспау керек, сонда ғана 
жарық кесінділер арқылы өте алады. Жарық микроскоптары арқылы тексеретін ұлпалардан 
кесінділер дайындау (препарат) өте күрделі жұмыс. Цитологиялық препараттар жасау бірнеше 
кезеңдерге бөлінеді: материал алу және оны бекіту, ұлпаларды тығыздау, парафинге күю, кесінділер 
жасау, бояу, бальзамға бекіту. 
Микроскоптың көру қабілеттілігі қолданылып отырған жарық ағымына байланысты және 
жарық ағынының 1/3 бөлігіне тең болады. Жарық толқынының ұзындыры неғұрлым қысқа болса, 
микроскоптың көру қабілеттілігі соғұрлым артады. Егер жарық толқынының ұзындығы 0,6 
миллимикрон (мкм) болса, микроскоптың көру қабілеттілігі - 0,2 мкм. Люминесцент микроскопы 

21 
ультракүлгін жарық толқынымен жұмыс істейді, толқын ұзындығы— 0,27—0,4 мкм. Осындай 
толқын препаратқа түскенде ол сәулені сіңіре отырып, өзінен жарық шығарады, бұл құбылыс 
флуоресценция деп аталады. Шыққан жарық толқыны сінген жарық толқынына қарағанда әрдайым 
ұзын болады. Кейбір заттар түскен жарық толқынының жартысын сіңіріп, өзінен жасыл, сары, 
қызыл спектрді шығарады. Флуоресценция деп заттарды ультракүлгін жарығымен 
шағырылыстырылғанда өзінен жарық бөлуін айтады. Оларға пигменттер, витаминдер, майлар 
жатады. Кейбір заттарды флюрохром бояуларымен бояу арқылы флуоресценцияны көруге болады. 
Мысалы, ДНК-ны акридин қызыл сары бояуымен боялғанда жасушадағы дизоксирибонуклеин 
қышқылы (ДНҚ) ашық жасыл сәуле береді, ал рибонуклеин қышқылы (РНҚ) ашық қызғылт сәуле 
береді. Бекітілгеннен кейін мүшелер бөліктерін концентрациясы жоғарлайтын спирттерде 
ығыстырып, спиртті ксилолға, одан кейін ксилолды парафинге салады. Осылайша, фиксацияланған 
ұлпа ауада қатып қалған тығыз парафинге айналады және оны кесуге болады. Қалыңдығы 5- мкм-
дей кесіндіні арнайы құрал микротом арқылы дайындайды. Мұндай кесінділер заттық шыныға 
бекітіліп, парафин ксилолда ерітіліп,құрамындағы су спиртпен ығыстырылады. Содан кейін 
кесінділерді суда еритін бояулармен бояуға болады. Тұрақты препараттар дайындау үшін боялған 
кесінділерді әйнек арқылы канадалық бальзаммен жабады, бұндай препараттарды ұзақ уақытқа 
дейін сақтауға болады. Бекітілген ұлпалар мен жасушаларды бояу үшін, әртүрлі табиғи және 
синтетикалық бояулар пайдаланады. Табиғи бояулармен (гемотоксилин, кармин т.б.) кешенді 
қосылыстар түзетін әртүрлі металдардың қышқылдары қолданады. 
Синтетикалық бояуларды қышқылды және негізгі деп бөледі. Негізгі бояуларда сілтілік 
қасиетін анықтайтын, құрамында амин топтары болатын тұздар негіздері болады. Мұндай бояулар 
жасуша құрылымында қышқылдық топтармен тұзды байланыстар құрайды. Қышқылдық бояулар 
құрамында гидроксильді топтар немесе СО2ОҺ топтарынан құралады. Негізгі (сілтілік) қасиетті 
жасуша құрылымы қышқылдық бояулармен байланысын ацидо- немесе оксифильді деп атайды. 
Клетка бөліктерін әр түрлі түске бір мезетте бояйтын түрлі бояулар коспалары қолданылады. 
Осындай бояуларды пайдалана отырып, тек жасушаның морфологиялық айқын суреттемесіне қоса 
оның химиялық кұрлымы жайлы мағлұматтар алуға болады. Ерекше химиялық заттарды 
анықтайтын бояуларға гистохимиялық және цитохимиялық бояулар жатады. Цитохимиялық талдау 
әдістері өте көп. Цитохимиялық реакцияға мысал ретінде ДНҚ-ға қолданатын кең таралған Фельген 
реакциясын айтуға болады. Маңыздылығы, тек ДНҚ-да спецификалық қышқылдық гидролизден 
кейін, дезоксирибоза пуриндердің ұсақталуынан альдегидті топтар пайда болады. Бұл топтар 
арнайы индикатормен, Шифф реактиымен қызыл түс береді. Бұл бояу арқылы ДНҚ-ны, оның санын 
анықтайды. Жеке амин қышқылдарымен (тирозин, триптофан, аргенин т.б.) реакциялар арқылы 
белоктардың таралуын анықтауға болады. Липидтер мен майлар жасушаларда жақсы еритін арнайы 
бояуларды айқындайды. 
Цитохимиялық реакциялар арқылы ферменттерді анықтауға болады. Бұл реакцияның жалпы 
принципі - микроскоп арқылы белокты ферменттердің өздері емес, өнімдердің белсенділіктерін 
анықтайтын таралу аймақтары көрінеді. 

жүктеу/скачать 1,63 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: