Оптимизация регуляторных последовательностей Недостаточный уровень экспрессии генов гетеро-
логического пути может быть обусловлен также
использованием неоптимальных регуляторных по-
следовательностей. Существуют два общих подхода
к выбору промоторов: 1) использование при возмож-
ности нативных промоторов генов пути; 2) замена
нативных промоторов регуляторной последователь-
ностью, специфичной для хозяина. Первый подход
обычно выбирают, если хозяин и организм-источник
гетерологического пути филогенетически близки
(например, два вида одного рода), и этот путь акти-
вен в организме-источнике [60]. Второй подход более
распространен, поскольку он позволяет экспресси-
ровать эволюционно отдаленные метаболические
пути в модельных организмах-хозяевах. Очевидным
недостатком этого подхода является необходимость
использования более сложных процедур молекуляр-
ного клонирования, но сегодня доступен набор раз-
личных инструментов, облегчающих эту задачу [34,
36, 61, 62].
Добиться оптимального соотношения фермен-
тов метаболического пути можно с помощью тонкой
настройки регуляторной последовательности [55].
В случае некоторых путей наиболее эффективно ис-
пользование эквимолярного соотношения фермен-
тов, которое можно получить, например, с помощью
саморасщепляющихся белков слияния, связанных
с помощью 2a-пептидной [63], LP4-пептидной [64],
двойной интеиновой последовательности [65] или по-
следовательности распознавания протеазы вируса
гравировки табака (TEV) [66, 67]. Для неэквимоляр-
ных соотношений полезным инструментом точной
настройки уровней экспрессии ферментов будет ис-
пользование промоторов различной силы. В настоя-
щее время существуют хорошо разработанные ме-
тодики определения необходимой силы промоторов
для каждого гена пути [68–70]. Сочетание желаемых
регуляторных последовательностей легко достигает-
ся с помощью технологий Gibson assembly и модуль-
ного клонирования Golden Gate [47, 71–74].
