В данном обзоре рассмотрены основные методы создания гетерологических биохимических путей в различных организмах, основные проблемы, воз- никающие при этом, и основные подходы к их ре- шению


GC-содержание и проблемы с предпочтением



Pdf көрінісі
бет10/15
Дата17.01.2023
өлшемі0,69 Mb.
#61672
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   15
Байланысты:
Лекция №6.1

GC-содержание и проблемы с предпочтением 
кодонов
Как упомянуто выше, определенная кодирующая по-
следовательность ДНК может быть получена либо 
непосредственно из исходного генома, либо синте-
зирована химически. В последнее время легкодо-
ступными и приемлемыми по цене стали технологии 
точного крупномасштабного синтеза ДНК (например, 
[75, 76]). Дополнительным преимуществом химиче-
ского синтеза является возможность модификации 
кодонов в кодирующих последовательностях гете-
рологического пути в соответствии с параметрами 
организма-хозяина [2]. Показано, что улучшение 
состава кодонов, приводящее к увеличению экс-
прессии гетерологических генов [77–79], может быть 
проведено либо вручную с помощью баз данных [80], 
либо с помощью бесплатных биоинформатических 
инструментов оптимизации кодонов [75, 81]. В свою 
очередь, оптимизация кодонов приводит к оптими-
зации содержания GC-пар в соответствии с предпо-
чтениями хозяина, что обеспечивает более легкую 
репликацию гетерологической ДНК в организме-хо-
зяине и таким образом снижает нагрузку от гетеро-
логического пути.
Оптимизация комбинации ферментов пути
Эффективность гетерологического пути не зави-
сит линейно от количества копий генов, входящих 
в него. Продукция метаболитов биосинтетического 
пути с увеличением дозы генов сначала возрастает, 
однако затем избыточная экспрессия гетерологиче-
ских белков приводит к значительному снижению 
выхода целевого соединения, поскольку внутрикле-
точное накопление метаболитов может приводить 
к запуску стресс-реакций, и клетки-хозяева не мо-
гут обеспечить необходимую скорость переработки 
накапливающихся метаболитов [25]. Поэтому добав-
ление дополнительных копий генов полезно только 
в случае генов ферментов лимитирующих стадий, 
но изменения количества копий других генов пути 
на выход конечного продукта практически не вли-
яют [82]. Например, показано, что дозирование ге-
нов эффективно при биосинтезе гетерологических 
β-каротиноидов в Yarrowia lipolytica [83]. 
Наиболее эффективный гетерологический путь 
может сочетать ферменты различного происхожде-
ния, гены которых происходят из нескольких мета-


36 | 
ACTA NATURAE
| ТОМ 12 № 2 (45) 2020
ОБЗОРЫ
болических путей или даже нескольких различных 
организмов [77]. В некоторых случаях достаточно 
комбинации ферментов, относящихся к родствен-
ным путям биосинтеза из разных источников [42, 84], 
тогда как в других требуется добавление вспомога-
тельных генов, кодирующих белки-активаторы, на-
пример фосфопантетинтрансферазу [85]. 
Пространственная близость активных центров 
ферментов способна повышать суммарную скорость 
конверсии гетерологического метаболита и снижать 
уровень накопления промежуточных соединений. 
Достигнуть такого сближения можно путем прямого 
слияния белков между собой или формирования бел-
ковых каркасов. Преимущество формирования бел-
ковых каркасов по сравнению с непосредственным 
слиянием заключается в сохранении аминокислотной 
последовательности фермента, что, как правило, по-
лезно для его функционирования. Используют три 
основных типа каркасов: ДНК-каркас, основанный 
на плазмидах и позволяющий легко изменять рас-
стояние между взаимодействующими белками, РНК-
каркас, преимущество которого заключается в не-
большом размере, и различные варианты белковых 
каркасов [55].
Внутриклеточная компартментализация фер-
ментов гетерологического пути накладывает огра-
ничения на продукцию метаболитов. К счастью, 
для митохондрий, эндоплазматического ретикулума, 
вакуолей, ядер, мембран и пероксисом эта проблема 
может быть решена путем совместной локализации 
всех ферментов в одном и том же компартменте с ис-
пользованием хорошо известных сигналов локали-
зации.
Ассоциированные с мембраной ферменты предъ-
являют самые строгие требования к внутрикле-
точной локализации, поэтому часто требуется со-
вместная локализация всех остальных ферментов 
метаболического пути в той же мембране [86]. Ранее 
были разработаны несколько коммерчески доступ-
ных наборов инструментов для правильного разме-
щения ферментов пути в специфических компар-
тментах дрожжей [86] и хлоропластов растений [42].
Конечной целью гетерологической экспрессии 
метаболических путей является продукция ценных 
вторичных метаболитов при помощи цепочки фер-
ментативных реакций, где размеры отдельных ре-
комбинантных белков не влияют на выход целевого 
продукта. Размер любого рекомбинантного белка ха-
рактеризуется длиной кодирующей его генетической 
последовательности, а также диктуется простран-
ственными ограничениями, налагаемыми клеточной 
и субклеточной компартментализацией гетерологи-
ческих путей в клетках-хозяевах. Таким образом, 
максимизация продукции гетерологических метабо-
литов представляет собой многоплановую проблему 
оптимизации, в которой вклад эффективности белков 
гетерологического пути преобладает над их количе-
ствами и размерами.


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   15




©emirsaba.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет