В. В. Зверева, М. Н. Бойченко
Методы, используемые для обнаружения микроба без выделения его в чистую
жүктеу/скачать 4,99 Mb. Pdf көрінісі
|
микробиология т-1, Зверев
| 5.6.2. Методы, используемые для обнаружения микроба без выделения его в чистую
культуру Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения, а также для обнаружения микроба в исследуемом материале без его выделения в чистую культуру. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радиоактивными нуклидами, ферментом, флюорохромным красителем, с которой сравнивают исследуемую ДНК. Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль, наличие которой фиксируют методами в зависимости от типа метки зонда: подсчетом радиоактивности, иммуноферментным анализом (ИФА) или денситометрией. Определение наличия микроба в исследуемом материале при помощи микрочипа Микрочип представляет стеклянную пластинку, с которой связано от 100 до 1000 молекулярных ДНК-зондов, которые представляют последовательность нуклеотидов, специфичных для данной таксономической единицы, локализованных в определенных участках (рис. 5.6). Рис. 5.6. Принцип обнаружения специфической последовательности ДНК при помощи микрочипа Из исследуемого образца выделяют общую ДНК, которую можно амплифицировать по стабильной последовательности 16S РНКгену. Выделенную ДНК метят флуорохромом или ферментом и обрабатывают ею микрочип, создавая условия для гибридизации. Отмывают несвязавшуюся ДНК, определяют локализацию молекулярных гибридов постановкой ИФА или денситометрией. 123 Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру. Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного микроба гена. Обнаружение гена осуществляют его накоплением. Для этого необходимо иметь праймеры (затравки) комплиментарного З'-концам ДНК исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняют следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях в случае комплементарности ДНК гена и праймера происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена увеличивается каждый раз вдвое (рис. 5.7). Проводят реакцию в специальных приборах - амплификаторах. Результат оценивают последующей денситометрией амплифицированной ДНК или ее электрофорезом в полиакриламидном геле. ПЦР применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций. ПЦР в реальном времени представляет ускоренный метод ПЦР, при котором амплификацию и определение продукта амплификации проводят одновременно. Для этой цели в амплификационную пробирку вводят молекулярный зонд, который в случае связывания с амплифицированной цепью генерирует флюоресцентный сигнал определенной длины волны. Реакцию проводят в автоматическом режиме. Рис. 5.7. Полимеразная цепная реакция (схема) 124 Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК используется для диагностики смешанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гибридизации амплифицированных рРНК, специфичных для определенного вида бактерий. Исследование проводят в три этапа: • амплификация пула рРНК на матрице выделенной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНКполимеразы; • гибридизация накопленного пула рРНК с комплиментарными видоспецифическими рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами; • определение продуктов гибридизации методами денситометрии, ИФА. Реакцию проводят в автоматическом режиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносят для гибридизации комплементарные видоспецифическим рРНК меченые олигонуклеотиды. жүктеу/скачать 4,99 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|