Высшее образование
Основные этапы развития генетической инженерии
жүктеу/скачать 5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 5.2. БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
- ней»
- У///Ш/Л
5.2. БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новы; методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. Используя технологию рекомбинантных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие: Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нук- леазами, что в значительной степени ускоряет выделение различи ных генов и манипуляции с ними. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фраг-, менте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и ко? дируемую им аминокислотную последовательность полипептида;, Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последователь! ности на основе их способности связывать комплементарные ос; нования. I Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК| фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмИ ду или вирус), который используют для трансформации бактери' Бактериальная клетка после трансформации способна воспрои" водить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифиЩ рованные версии генов и затем внедрять их в клетки или органи' мы. Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное вс действие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие 31 дачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получать многие белки, участвующие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма. Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами — рест- рикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы: используемые для получения фрагментов ДНК; синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК; соединяющие фрагменты ДНК; позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК; применяемые для приготовления гибридизационных проб. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4 —6 ну- клеотидов. Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз. Согласно номенклатуре, предложенной Х.Смитом и Д.Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие — первые буквы вида. Например, фермент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae — Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т.д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двуни- тевую ДНК с образованием серии Рис 5л участки узнавания Фрагментов, называемых рестрикци- дНК тремя реСтриктазами из онными (или рестриктами; с тупы- Haemophilus parainfluenzae МИ либо липкими концами (рис. 5.1). (Hpal); Escherichia coli (EcoRI)
5'—G—Т-Т-- 3'-C-A-A-|-T-T-G -5' Расщепление EcoRI A—A—T—Т— С—3' 5-G-j- 3'—С—T—T—A—A--G— 5' Расщепление Hindlll •A—G—С—Т— Т— 3' 5'- А 3'~Т—T—С—G—А+А—5' Расщепление Многие рестриктазы вносят разры- и Haemophilus influenzae вы в две цепи ДНК со смещением на (Hindlll) несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагменте! коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепо- чечным участком, полученным с помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любы;, фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазми- ды или бактериального вируса. Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии межд\ отдельными генами (участками) без определения их нуклеотид ной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач. Для успешного решения задач генетической инженерии оченж важно быстро секвенировать (определить последовательность нук| леотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее врем$ объем информации о последовательностях ДНК столь велик, чт<| для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах ней» обходимы новые технологии и компьютерная техника. « 32 32 132 32 32 Рис. 5.2. Схема получения семейства меченных по 5'-концу фрагмен ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А ) В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполнении й результативны. Результаты секвенирования позволяют также на основе генетического кода определить аминокислотную последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене. На рис. 5.2 представлена схема химического метода секвенирования ДНК Исходный фрагмент ДНК, меченный 32Р по 5'-концу, подвергается специфическому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты разной длины, которые разделяются по размерам при гель-электрофорезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавтографии. Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использованием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его результатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3). Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматичес- ком введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибо- нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З'-ОН, представленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифицированный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК- полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (прайме- ра) и небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять меченую ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использованием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электро- форетический анализ проводить на четырех дорожках геля, то можно определить последовательность нуклеотидов. В настоящее время используют модифицированный метод, сводящийся к флуоресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе движения по одной дорожке геля. Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 "С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит Последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химического метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нук- леотиду на 5'-конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) проводят анализ послойно всех дорожек к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для решения эволюционных и филогенетических проблем. Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нук- леотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по 32Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч-А 5'У///////Л GCTACCTGCATGGA з'ШЯгггШгЕс CGATGGACGTACCTCTGAAGCG ^ gctacctgcatgga Y/МШЛ GCTA УМ////М ГгГТАГГТГ.ГА СИЗ
У///Ш/Л Рис. 5.4. Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кислот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего цепь: ную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Размеры его варьируют от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч нуклеотидов. Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности щщш ?
в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое количество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК- зонду, присутствует в геноме клетки. ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов; в реакциях гибридизации с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для выявления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК- зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. coli. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса: общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. В процессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые особым сайт-специфическим ферментом, что приводит к трансформации распределения нуклеотидных последовательностей в геноме. Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомологичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих такие одноцепочечные разрывы, относят: химические агенты, некоторые виды излучения, специфические белки. Например, у Е. coli обнаружен белок rec BCD, который вызывает в молекулах ДНК одноцепочечные разрывы. Белок rec BCD представляет собой ДНК- зависимую АТРазу, которая действует как ДНК-хеликаза, перемещающаяся по спирали ДНК и вызывающая ее расплетение. Под влиянием этого белка, обладающего нуклеазной и хеликазной активностью, на двойной спирали ДНК возникает разрыв с образованием одноцепочечного участка «ус» (whisker) (рис. 5.5). Белок rec BCD присоединяется к двойной спирали ДНК с одного конца (5') и со скоростью около 300 нуклеотидов в секунд у движется вдоль спирали ДНК за счет гидролиза АТР. Одновременно с белком движется и возникшая петля ДНК. Когда петля на спирали достигает участка, называемого сайтом узнавания (recognition site), одна из цепей разрывается с освобождением небольшого одноцепочечного участка «ус». Возникший «ус» инициирует дальнейшую генетическую рекомбинацию. Белок rec BCD Рис. 5.5. Схема процесса общей рекомбинации с участием белка rec BCD у E.coli: А — двойная спираль ДНК; Б — присоединение к двойной спирали белка rec BCD с последующим его перемещением; В — возникновение разрыва в сайте узнавания; Г — образование одноцепочечного участка «ус» + В процессе общей генетической рекомбинации центральная роль отводится комплементарным взаимодействиям нуклеотид- ных последовательностей. Кроме того, этот процесс требует участия особого белка гесА с Mr, равной 38 кДа. Белок гесА прочно связывается в виде крупных кластеров с одиночными цепями ДНК, одновременно удерживая и двойную спираль. За счет двух сайтов данный белок имеет еще один участок — для связывания и гидролиза АТР, т.е. он представляет собой ДНК-зависимую АТРазу. Благодаря особенностям белка гесА осуществляются од-L Обмен между цепями Высвобождение одной из цепей Разрыв ноцепочечный обмен между двумя двойными спиралями (рис. 5. с удалением некоторого количества нуклеотидов и локальный ре синтез ДНК. Разрыв в одной из цепей ДНК высвобождает эту цепь, и он внедряется во вторую спираль, образуя короткий спаренный учас ток. После начального обмена roMi логичные нуклеотидные последовг тельности двух взаимодействующв спиралей устанавливаются в строго соответствии одна с другой, в связс с чем происходит расширение обл? сти спаривания и быстрый обме между спиралями. Для этого процеа, разные организмы используют нес динаковые механизмы, большинств из которых включает в качестве прс межуточного этапа обмен с перекр. щиванием цепей между двумя сш ралями ДНК (рис. 5.7). Структура, образующаяся при оР мене с перекрещиванием цепей, сС держит две перекрещенные и две н перекрещенные цепи. Она способ? : существовать в различных изомернР
Разрыв цепи и обмен Разрыв цепи и обмен ♦ Сшивание разорванных цепей Равноценные структуры Рис. 5.7. Схема образования структуры с перекрещиванием цепей между двумя спиралями ДНК формах. Изомеризация меняет пол| жение двух пар цепей: две ранее п! рекрещивающиеся цепи становяТ( неперекрещивающимися и наобор<1 Для того чтобы восстановили^ две отдельные спирали ДНК и flj самым прекратился процесс спар вания, в каждой из двух перекрещён ных цепей должен произойти разр! (рис. 5.8) . AT Г Ц AATT ЦАГТЦ ТАЦГ ТТААГТЦАГ АТГЦ-ААТТ-ЦАГТЦ ТАЦГ-ТТАА-ГТЦАГ -АТГЦААТТ ЦТГАГАТЦЦА ТАЦГ ТАЦГ ТТААГАЦТЦТ АГГТАТГЦ ТАЦГЦЦЦ Г Г ГЦА Т Г .ААТТ^ЦАТГТАТГГТГГЦТТТЦТГТАА ГТАЦАТАЦЦАЦЦГАААГАЦАТТЦТАГ'^ Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гень осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» кой* цам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.1 взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4—6 пар нукле< тидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лиг^ зой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи меж!| соседними нуклеотидами: |