ДНҚ секвенирлеу – ДНҚ толық молекуласының немесе фрагментінің нуклеотидтіқ бірізділігін анықтау
Кезеңдері:
Зерттелетін фрагментті праймермен будандастыру.
ДНҚ-ың ферментативті синтезі.
Алынған өнімдердің формамидпен денатурациясы (ұзындығы әртүрлі праймер бар олигонуклеотид тізбегі пайда болады).
Төрт жолдағы полиакриламидті гельдегі электрофорез (нуклеотид түрлерінің санына сәйкес).
Радиоавтография бойынша нәтижелерді талдау
ДНҚ-ны секвенирлеудің нәтижесі
V. Рестрикциялық талдау .
Рестрикциялық эндонуклеазаларының алуан түрі 150-ден астам тану орнында ДНҚ-ны кесуге мүмкіндік береді. Рестрикциялық талдаудың маңызды элементтерінің бірі ДНҚ-ның белгілі бастапқы құрылымы негізінде анықталған ДНҚ фрагменттерінің бөлінуінің теориялық есептелген көрінісін алу болып табылады. ДНҚ мөлшері аз болған жағдайда, әдетте Vector, NTI, Lasergene, Dnasis Max бағдарламалық жасақтамалары осы мақсаттар үшін қолданылады.
VI Саузерн-блот гибридизация (Southern blot hybridization)
ДНҚ-ның белгілі бір фрагменттері Саузерн блот-будандастыру арқылы анықталады
Кезеңдері:
1. Электрофорезден кейін гель сілтілік ерітіндіге салынып, ДНҚ бір тізбекті болады.
3. Фрагменттерді визуалды түрде анықтау үшін олар флюоресценттін белгіленген немесе радионуклидпен белгіленген олигонуклеотидтермен (ұзындығы 16-30 нуклеотидтен тұратын зонд) немесе клондалған ДНҚ мен гибридизациялау.
4. Сүзгі затбелгісі бар зондты ерітіндімен инкубациялағанда зонд ДНҚ-ның қосымша тізбектері мен фильтрдегі фрагменттер будандастырылады. Нақты емес зонд молекулалары арнайы процедураны қолданып жуылады. Фильтрдінбетінде зондты ДНҚ- мен белгіленген жолақтар көрінеді.
Глоссарий
1. Молекулалық-генетикалық әдістер - ДНҚ фрагменттерін талдауға, жекелеген гендермен олардың сегменттерін тауып, оқшаулауға және нуклеотидтердің бірізділігін анықтауға мүмкіндік береді.
2.Амплификация –ДНҚ-ның фрагменттерін ПТР әдісі арқылы көбейту.
3. ДНҚ-ны фрагменттерге рестрикциялау (кесу) - молекулалық-генетикалық диагностиканың қажетті негізгі кезеңі, ферменттермен рестрикцияның бактериялық эндо-нуклеазаларымен (рестриктазалармен) жасалады. Бірнеше ондаған рестриктаз қолданылады. Олар екі тізбекті ДНҚ-ны тек бірнеше жерлерін кесе алады
4. ДНҚ фрагменттерінің электрофорезі – ДНҚ фрагмент-терін агарозды гелмен бөлу. ДНҚ электрофорезі арнайы құрылғы - электрофоретикалық камераның көмегімен жасалады. Камерада полюстері әртүрлі электродтар бо-лады, теріс электрод аймағына ДНҚ фрагменттерінің үлгісі енгізіледі. Тұрақты электрлік алаң әсерінен ДНҚ фрагменттерін олардың көле-мі мен молекулалық массасына байланысты бөледі (теріс полюс-тан оңға қарай қозғалады). ДНҚ электрофорезі молекулалық-генети-калық диагностиканың әртүрлі әдіс-терінде қолданылады.
5. ДНҚ секвенирлеу – ДНҚ толық молекуласының немесе фраг-ментінің нуклеотидтіқ бірізділігін анықтау. ДНҚ секвенирлеу – ДНҚ зерттеудің қымбат әдісі болып табы-лады, арнайы құрылғы - генетикалық анализаторды (секвенатор) қолданып жасалады6.
