Бөлу механизмі бойынша hplc әдістерін жіктеу
жүктеу/скачать 21,96 Kb.
|
|
БӨЛУ МЕХАНИЗМІ БОЙЫНША HPLC ӘДІСТЕРІН ЖІКТЕУ Жоғары тиімді сұйық хроматографиясы әдісімен жүргізілетін бөлімдердің көпшілігі заттардың сорбентпен өзара әрекеттесуінің аралас механизміне негізделген, бұл компоненттердің бағанда азды-көпті сақталуын қамтамасыз етеді. Бөлу механизмдері азды-көпті таза түрде іс жүзінде сирек кездеседі. Бөлінетін заттың (элюаттың) стационарлық фазамен өзара әрекеттесу механизміне сәйкес адсорбциялық, тарату, ион алмасу, эксклюзивті хроматографиялар деп ажыратылады. АДСОРБЦИЯЛЫҚ ХРОМАТОГРАФИЯ Адсорбциялық хроматография әдісімен бөлу заттың бетінде белсенді орталықтары бар силикагель немесе алюминий оксиді сияқты адсорбенттермен әрекеттесуі нәтижесінде жүзеге асырылады. Әртүрлі үлгі молекулаларының адсорбциялық орталықтарымен өзара әрекеттесу қабілетінің айырмашылығы олардың баған бойынша жылжымалы фазалық қозғалыс процесінде аймақтарға бөлінуіне әкеледі. Бұл жағдайда компоненттер аймақтарының бөлінуі еріткішпен де, адсорбентпен де өзара әрекеттесуге байланысты. Гидроксил топтары бар адсорбент бетіндегі сорбцияның негізінде адсорбенттің полярлық беті мен молекулалардың полярлық (немесе поляризациялауға қабілетті) топтары немесе учаскелері арасындағы ерекше өзара әрекеттесу жатыр. Мұндай өзара әрекеттесулерге тұрақты немесе индукцияланған дипольдер арасындағы дипольдипольдік өзара әрекеттесу, π - кешендер немесе зарядты тасымалдау кешендері пайда болғанға дейін сутегі байланысының түзілуі жатады. Практикалық жұмыста мүмкін және жиі кездесетін химосорбцияның көрінісі болып табылады, бұл ұстау уақытының едәуір артуына, тиімділіктің күрт төмендеуіне, ыдырау өнімдерінің пайда болуына немесе заттың қайтымсыз сорбциясына әкелуі мүмкін. Заттардың адсорбциялық изотермалары сызықты, дөңес немесе ойыс пішінді болады. Адсорбцияның сызықтық изотермасында заттың шыңы симметриялы және ұстау уақыты үлгінің мөлшеріне байланысты емес. Көбінесе заттардың адсорбциялық изотермалары сызықты емес және дөңес пішінді болады, бұл құйрықты қалыптастыру үшін шыңның кейбір асимметриясына әкеледі. Жоғары тиімді сұйық хроматографиясында ең көп қолданылатындар әр-түрлі кеуек көлемі, беті, кеуек диаметрі бар силикагельді адсорбенттер. Алюминий оксиді сирек қолданылады және өте сирек кездеседі-классикалық бағаналы және жұқа қабатты хроматографияда кеңінен қолданылатын басқа адсорбенттер. Мұның басты себебі-басқа адсорбенттердің көпшілігінің механикалық беріктігінің жеткіліксіздігі, оларды орауға және Жоғары тиімді сұйық хроматографиясына тән жоғары қысымда қолдануға мүмкіндік бермейді. Адсорбцияны анықтайтын және силикагель мен алюминий оксидінің бетінде орналасқан полярлық топтар қасиеттері жағынан жақын. Сондықтан, әдетте, заттар қоспаларын элюциялау тәртібі және олар үшін еріткіштердің элютропты қатары бірдей. Алайда, силикагель мен алюминий оксидінің химиялық құрылымындағы айырмашылық кейде селективтіліктің айырмашылығына әкеледі-содан кейін белгілі бір тапсырмаға сәйкес келетін адсорбентке немесе басқасына артықшылық беріледі. Мысалы, алюминий оксиді кейбір көп ядролы аро-матикалық көмірсутектерді бөлу кезінде үлкен селективтілікті қамтамасыз етеді. Әдетте силикагельге алюминий оксидімен салыстырғанда артықшылық кеуектілігі, беті және кеуектер диаметрі бойынша силикагельдердің кең таңдауымен, сондай-ақ алюминий оксидінің едәуір жоғары каталитикалық белсенділігімен түсіндіріледі, бұл көбінесе сынама компоненттерінің ыдырауы немесе олардың қайтымсыз химосорбциясы салдарынан талдау нәтижелерінің бұрмалануына әкеледі. ТАРАТУ ХРОМАТОГРАФИЯСЫ Тарату хроматографиясы-Жоғары тиімді сұйық хроматографиясы нұсқасы, онда қоспаны компоненттерге бөлу олардың екі араласпайтын фазалар арасындағы таралу коэффициенттерін ажырату арқылы жүзеге асырылады: еріткіш (жылжымалы фаза) және Сорбент фазасы (қозғалмайтын фаза). Тарихи тұрғыдан алғанда, сұйық фазаларды (оксидипропионитрил, парафин майы және т.б.) кеуекті тасымалдаушыларға қолдану арқылы алынған сорбенттердің бұл түрі Газ-сұйық хроматография (GGC) үшін сорбенттерді дайындау және дайындау әдісіне ұқсас болды. Алайда, мұндай сорбенттердің кемшіліктері бірден табылды, олардың негізгісі тасымалдаушыдан фазаны салыстырмалы түрде тез жуу болды. Осының арқасында бағандағы фазаның саны біртіндеп азайды, ұстау уақыты да азайды, бағанның бастапқы бөлігінде фазасыз адсорбция орталықтары пайда болып, шыңдар құйрықтарының пайда болуына себеп болды. Бұл кемшілікпен күресіп, еріткішті бағанға түскенге дейін қолданылған фазамен қанықтырды. Тұтқыр және аз еритін полимер фазалары қолданылған кезде де шығын азайды, бірақ бұл жағдайда қалың полимерлі пленкалардың диффузиясының қиындығына байланысты колонкалардың тиімділігі айтарлықтай төмендеді. Сұйық фазаны химиялық байланыстармен тасымалдаушыға физикалық түрде алып кету мүмкін болмайтындай етіп егу қисынды болып шықты, яғни.тасымалдаушы мен фазаны бір бүтінге егу фазалық сорбент деп аталады. Алғашқы вакцинация-фазалық сорбенттер силикагель бетіндегі силанол топтарын спирттермен немесе аминдермен әрекеттесу нәтижесінде алмастыру арқылы алынды. Бұл жағдайда су бөлініп, спирттердің немесе аминдердің қалдықтары химиялық жолмен силикагель бетіне егілді. Бұл "щетка" деп аталатын сорбенттер оларды қолдану арқылы бағаннан фазаны алып тастау және ұстау уақытының тұрақтылығы болмаған кезде динамиктердің жоғары тиімділігін алуға болатынын көрсетті. Алайда, мұндай сорбенттердің Сулы еріткіштерді, тіпті әлсіз негізді немесе қышқыл орталарды қолдану жағдайында төзімділігі төмен болды: фаза гидролиз реакциясы арқылы химиялық жолмен бөлініп шықты. Болашақта зерттеушілердің күш-жігері егу тез және толық жүретін реагенттерді іздеуге бағытталды, ал пайда болған байланыстар мүмкіндігінше тұрақты болды. Мұндай реагенттер алкилхлорсиландар және олардың туындылары болды, олар ұқсас технология бойынша әртүрлі типтегі және бетінде әртүрлі полярлы және полярлы емес топтары бар вакцинофазалық сорбенттерді алуға мүмкіндік берді. Жоғары тиімді сұйық хроматографиясы үшін соңғы типтегі сорбенттерді сәтті қолдану олардың өндірісінің әр түрлі өндірушілердің өсуіне ықпал етті. Әрбір фирма мұндай сорбенттерді, әдетте, силикагельдің түріне және әдетте өндірістің "ноу-хауын" құрайтын технологиясына сүйене отырып шығарды. Нәтижесінде химиялық тұрғыдан бірдей деп аталатын сорбенттердің көп мөлшері (мысалы, егілген октадецилсилан силикагелі) өте әртүрлі хроматографиялық сипаттамаларға ие. Себебі силикагельдің тері тесігі кеңірек немесе тар болуы мүмкін, беті әр түрлі, кеуектілігі, егу алдындағы беті гидроксилденуі немесе болмауы мүмкін, моно -, ди - немесе трихлорсиландар егілуі мүмкін, егу жағдайлары мономерлі, полимерлі немесе аралас фаза қабатын бере алады, реагенттердің қалдықтарын жоюдың әртүрлі әдістері қолданылады, қолдануға немесе қолдануға болады силанолды және басқа белсенді топтарды қосымша залалсыздандыру қолданылмайды. Реагенттерді егу және шикізат пен материалдарды дайындау технологиясының күрделілігі, оның көп сатылы болуы тіпті бір компания өндірушісінде алынған сорбенттер партиясының хроматографиялық сипаттамалары біршама өзгеше болуы мүмкін екендігіне әкеледі. Бұл, әсіресе, мұндай сорбенттер функционалды топтардың саны мен орналасуында, функционалдылық сипатында айтарлықтай ерекшеленетін заттар бар көп компонентті қоспаларды талдау үшін қолданылатын жағдайларға қатысты жоғарыда айтылғандарды ескере отырып, әрдайым әдебиетте сипатталған талдау әдісін қолданған кезде дәл сол сорбентті және сол жұмыс жағдайларын қолдануға тырысу керек. Бұл жағдайда жұмысты қайталай алмау ықтималдығы минималды. Егер мұндай мүмкіндік болмаса және ұқсас егілген фазасы бар басқа компанияның сорбенті алынса, сіз техниканы қайта құру үшін ұзақ жұмыс қажет болатындығына дайын болуыңыз керек. Сонымен қатар, бұл сорбентте, тіпті ұзақ уақыт дамығаннан кейін де, қажетті бөлуді жеңе алмау мүмкіндігі бар (және оны ескеру керек). Әдебиетте бұрыннан өндірілген ескі сорбенттерде сипатталған көптеген бөлу әдістерінің болуы оларды одан әрі өндіруге және осы себепті қолдануға ынталандырады. Алайда, түпнұсқа әдістерді әзірлеуге көшуге тура келетін жағдайларда, әсіресе ыдырауға, химосорбцияға, қайта топтастыруға бейім заттарға қатысты, жақында жасалған және технологияның жаңа, жетілдірілген нұсқалары бойынша шығарылатын сорбенттерде жұмысты бастаған жөн. ИОН АЛМАСУ ХРОМАТОГРАФИЯСЫ. Ион алмасу хроматографиясында қоспаның компоненттерін бөлуге иондаушы заттардың сорбенттің иондық топтарымен қайтымды әрекеттесуі арқылы қол жеткізіледі. Сорбенттің электронейтралдылығын сақтау бетіне жақын орналасқан ион алмасуға қабілетті анти-иондардың болуымен қамтамасыз етіледі. Енгізілген үлгінің ионы сорбенттің тұрақты зарядымен әрекеттесіп, қарсы ионмен алмасады. Бекітілген зарядқа әр түрлі жақындығы бар заттар аниониттерде немесе катиониттерде бөлінеді. Аниониттердің бетінде оң зарядталған топтар бар және олар жылжымалы фазадан аниондарды сорбциялайды. Катиониттерде сәйкесінше катиондармен әрекеттесетін теріс зарядты топтар болады. Сұйық аммиак түріндегі қышқыл тұздарының, негіздердің және еріткіштердің сулы ерітінділері жылжымалы фаза ретінде қолданылады, яғни. жоғары диэлектрлік өткізгіштік мәні ε және қосылыстарды иондауға үлкен бейімділігі бар еріткіштер жүйесі. Олар әдетте рН мәнін реттеуге мүмкіндік беретін буферлік ерітінділермен жұмыс істейді. Прихроматографиялық бөлуанализденетін заттарэлюентте кездесетін иондармен бәсекелеседі, қарама-қарсы зарядталған Сорбент топтарымен әрекеттесуге ұмтылады. Демек, ион алмасу хроматографиясын қандай да бір жолмен иондалуы мүмкін кез келген қосылыстарды бөлу үшін қолдануға болады. Тіпті бейтарап қант молекулаларын олардың борат ионымен кешендері түрінде талдауға болады: Қант + ВО32-Сахар қант ВО32- Ион алмасу хроматографиясы жоғары полярлы заттарды бөлу кезінде өте қажет, оларды туындыларға аудармай GGC әдісімен талдау мүмкін емес. Мұндай қосылыстарға аминқышқылдары, пептидтер, қанттар жатады. Ион алмасу хроматографиясы медицинада, биологияда, биохимияда қоршаған ортаны бақылау үшін, қандағы және зәрдегі дәрі-дәрмектер мен олардың метаболиттерін, тамақ шикізатындағы улы химикаттарды талдауда, сондай-ақ бейорганикалық қосылыстарды, соның ішінде Радиоизотоптарды, лантаноидтарды, актиноидтарды және т. б. биополимерлерді талдау (белоктар, нуклеин қышқылдары және т. б.), әдетте сағаттар немесе күндер жұмсалған, ион алмасу хроматографиясының көмегімен 20-40 минутта жақсы бөлінумен өткізіледі. Биологияда ион алмасу хроматографиясын қолдану үлгілерді тікелей биоорталарда бақылауға мүмкіндік берді, бұл қайта топтастыру немесе изомерлеу мүмкіндігін азайтады, бұл соңғы нәтижені дұрыс түсіндірмеуге әкелуі мүмкін. Бұл әдісті дене сұйықтықтарымен болатын өзгерістерді бақылау үшін қолдану қызықты. Силикагель негізіндегі кеуекті әлсіз анион алмастырғыштарды қолдану пептидтерді бөлуге мүмкіндік берді. Ион алмасу механизмін келесі теңдеулер түрінде ұсынуға болады: катион алмасу үшін анион алмасу үшін X - +R + Y-Y Y - +R + X-X+ + R-Y+ Y Y + + R-x+ Бірінші жағдайда x үлгісінің ионы Y фазасының ионымен R+ ион алмастырғыштың иондық орталықтары үшін бәсекелеседі, ал екіншісінде R+ иондық орталықтары үшін Y+жылжымалы фазасының иондарымен бәсекелеседі - x + үлгісінің катиондары.Әрине, бұл бәсекелестікте ион алмастырғышпен әлсіз әрекеттесетін үлгі иондары бағанда әлсіз ұсталып, одан бірінші болып жуылады және керісінше, қатты ұсталған иондар бағаннан соңғы болып элюцияланады. Әдетте иондық емес табиғаттың қайталама өзара әрекеттесуі үлгінің матрицаның иондық емес бөлігімен адсорбциясы немесе сутегі байланыстары немесе үлгінің жылжымалы фазадағы шектеулі ерігіштігі арқылы пайда болады. "Классикалық" ион алмасу хроматографиясын "таза" түрде бөліп көрсету қиын, сондықтан кейбір хроматографистер ион алмасу хроматографиясындағы теориялық емес, эмпирикалық заңдылықтардан туындайды. Нақты заттардың бөлінуі, ең алдымен, ең қолайлы сорбентті және жылжымалы фазаны таңдауға байланысты. Ион алмасу хроматографиясында қозғалмайтын фазалар ретінде ион алмасу шайырлары мен егілген ионогендік топтары бар силикагельдер қолданылады. 10 мкм немесе одан аз полистиролды HPLC ион алмасу шайырлары селективтілік пен тұрақтылыққа ие, бірақ олардың торлы құрылымы 1,5 нм тор түйіндері арасындағы қашықтықпен сипатталады, бұл адсорбциялық хроматография үшін қолданылатын силикагельдің (10 нм) кеуек өлшемінен едәуір аз, масса алмасуды баяулатады, сондықтан тиімділікті айтарлықтай төмендетеді. Жоғары тиімді сұйық хроматографиясында қолданылатын ион алмастырғыш шайырлар негізінен стирол және дивинилбензол сополимерлері болып табылады. Әдетте соңғысының 8-12% қосылады. Дивинилбензолдың мөлшері неғұрлым көп болса, полимердің қаттылығы мен беріктігі соғұрлым жоғары болады, сыйымдылығы жоғары болады және әдетте селективтілік пен ісіну аз болады. Катиониттер матрицаны сульфаттау арқылы алынады. Сульфо тобымен иондық байланысқан Протон қозғалуы мүмкін, тіпті шайырдан тыс ерітіндіге ауысуы мүмкін. Бұл жағдайда молекуланың жалпы электронейтралды болуы үшін Протонның орнын ерітіндіден шайырға өтетін оң зарядталған ион алады. Мысалы, na+cl - Н+формасындағы катион алмасу шайырына әсер еткенде, алмасу реакциясы жүреді: Шайыр-SO4-H+ + Na - → шайыр-SO3-Na+ + H+ Егер реакция соңына дейін жүрсе, онда шайыр натрий (ион) түрінде болады. Анион алмасу шайырлары матрицаны хлорлау және кейіннен алифатты аминмен алкилдеу арқылы алынады. ЭКСКЛЮЗИВТІ ХРОМАТОГРАФИЯ Эксклюзивті хроматография сұйық хроматографияның нұсқасы болып табылады, онда бөліну Сорбент кеуектерінің ішіндегі еріткіш пен оның бөлшектері арасында ағып жатқан еріткіш арасында молекулалардың таралуы арқылы жүреді. Жоғары тиімді сұйық хроматографиясының басқа нұсқаларынан айырмашылығы, мұнда бөлу компоненттердің Сорбент бетімен әр түрлі өзара әрекеттесуіне байланысты, эксклюзивті хроматографиядағы қатты толтырғыштың рөлі тек белгілі бір мөлшердегі кеуектерді қалыптастыру болып табылады, ал стационарлық фаза-бұл кеуектерді толтыратын еріткіш. Сондықтан "сорбент" терминін осы толтырғыштарға қолдану белгілі бір дәрежеде шартты болып табылады. Әдістің негізгі ерекшелігі - молекулаларды олардың 8 өлшеміне қарай кез-келген молекулалық масса диапазонындағы ерітіндіде бөлу мүмкіндігі-102-ден 10-ға дейін , бұл оны синтетикалық және биополимерлерді зерттеу үшін қажет етеді. Дәстүр бойынша, органикалық еріткіштерде жүргізілетін процесс әлі күнге дейін гельдік ену деп аталады, ал су жүйелерінде гельді сүзу хроматографиясы деп аталады. Бұл кітапта екі нұсқа үшін де бірыңғай термин қабылданған, ол ағылшынның "Size Exclusion" сөзінен шыққан — өлшемі бойынша ерекшелік — және процесс механизмін барынша толық көрсетеді. Монографияларда эксклюзивті хроматография процесінің өте күрделі теориясы туралы бар идеяларды егжей-тегжейлі талдау жүргізілді.Біз практикалық жұмыс үшін жеткілікті әдістің негізгі негіздерін ғана қарастырамыз. жүктеу/скачать 21,96 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|