Протопласттарды бөліп алу және культураға ендіру әдістемесі
жүктеу/скачать 16,56 Kb.
|
1 2
|
Протопласттарды бөліп алу және культураға ендіру әдістемесі Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты.Олар атап айтқанда:ұлпаның шығу тегі (жапырақ,тұқым жапырақ,тамыр,тозаң түйірі,каллус ұлпасы,суспензиядағы клеткалар),өсімдіктің түрі мен сорты,өсімдіктің физиологиялық күйі,ферменттердің құрамы,олардфың сапасы,ортаның Рн және осмостық заттың түрі. Протопластардың тіршілікке икемділігін ,яғни олардың метоболиттік активті-лігін анықтайтын арнайы әдіс бар .Ол протопластардың флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы.ФДА бұл флуоресценциясы жоқ қосылыс,протопластар мембранасы арқылы жеңіл өтеді,тірі протопластардың ішінде эстеразалардың әсерімен ыдырайды.Соның нәтижесінде флуоресцеин босайды,оны прото-пластардың бүтін мембраналары ұмтап қалады.Сондықтан метоболиттік активтыілігі бар (тіршілікке қабілетті) протопластар ультра күлгін сәулесінде көзге көрінеді,себебі жинақталған флуоресцеин ультро күлгін сәулесімен қоз-дырылып,жасыл сәулені тарата бастайды. Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың саны мен (процент мөлшерінде) белгіленеді.Протопластардың саны Фукс-Резонталь камерасында есептеледі.Протоплдастардың тығыздығы (суспензияның 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы.Егер ұлпаның немесе өсірген клеткалардың ылғалды массасының 1 гр-нан 1 х 103 тен 1 х104 ке дейін тіршілікке икемді протопластар шықса,онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі. Жоғарыда айтылып кеткендей,протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардың өміршеңдігі сімдіктің түріне,жасына және физиологиялық күйі-не,яғни генетикалық және эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты. Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайды өсу кезеңін нақтылы бір мүшесін анықтап таңдап алуы қажет. In vitro өскен клеткалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай артықшылықтары бар:стирильдік, In vitro жағдайларында өсіруге бейімділік.Бірақ клетка қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және оның қалыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады.Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген клеткалардың ішінде меристемалық клеткаларының сан жағынан үйлесіне сай болады,ал ол үшін суспенциядағы клеткаларды жиі-жиі жаңа коректік ортаға көшіріп отыруы керек. Суспензияда өсірген клеткалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мерзім,ол клеткалардың өсу кезеңінің лагарифмдік фазасының соңында.Осы мезгілде клетка қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап,өміршең протопластарды береді.Протопластардың тіршілікке екемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты.Клетканың плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді.Бұл жағдайда цитоплазмангың вокуольденуі артады,көптеген липид тамыршалары пайда болады,полисомалардың саны азаяды,ядромен хлоропластар қоюланады. Фермент препаратының сапасы протлпластардың бөліп алынған санына,мөлшеріне ғана емес,олардың кейбір қасиеттерінеде әсер етеді.Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препаратына қоспа ретінде протезалар,липазалар,нуклеазалар және басқа ферменттер,фенолдық қосылыстар,тұздар кіреді.Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін.Осы токсикалық заттардан құтылуы үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады.Бірақ айта кететін мәселе өте жақсы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді.Кейде ферменттік ерітіндісі қорғаушы заттар (протекторлар) қосы-лады,мысалы:калий сульфатының 0,5 процент ерітінділері.Олар протеин-дермен әрекеттесіп,ферменттердің зиянды әсерін төмендетеді. Инкубациялық ортада иондардың,әсіресе кальций мен магнийдің болуы плазмалемманың тұрақтылығын арттырып оқшауланған протопластардың сапасын жақсартады.Оқшауланған протопластар механикалық және осмостық стреске өте сезімтал болады.Олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде өздерінің осмостық тұрақтылығын сақтай алады. Ферменттік ертіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып,біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бұзылған құрылымдарын жөніне келтіріп (репарация),қабығын қайта құруға (регенерация) дайындалады.Толық жарамды изотониялық қоректік ортада (протопласт пен ортаның осмостық қысымы тепе-тең) асептикалық жағдайда протопластар ұзақ мезгіл тіршілікке икемді болып,бөлінуге қабылетін сақтайды. жүктеу/скачать 16,56 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|
1 2