6В05102- «Биотехнология» мамандығы бойынша «Иммундық биотехнология» пәнінен №10 дәріс
жүктеу/скачать 1,48 Mb.
|
10-лекция
| аминоптерин қосылса, онда бұл ортада ферменті жоқ миелома жасушалары (Г/ГФРТ) нуклеин қышқылдарының синтезін қамтамасыз ете алмайды және өледі.
Гибридоманың мутантты жасушалары-нуклеотидтердің синтезінің резервтік жолынан айырылған және гипоксантинмен ортада олар өледі. Бұл мәселені шешу үшін Гат селективті ортасын қолданылады(гипоксантин - аминоптерин - тимидин бар культуральді орта). Аминоптерин бар мұндай ортада нуклеотидтер синтезінің негізгі жолы бұғатталады, ал гипоксантин мен тимидиннің болуы нуклеотидтердің қосалқы жол бойымен синтезін қамтамасыз етеді. Мұндай жағдайларда миелома жасушалары өледі және тек будандар функционалды белсенді болып қалады. В лимфоциттері in vitro өсуіне бейімделмеген, олар тез бұзылады, бұл селекция процесін жеңілдетеді Селекцияның негізігі міндеті гибридті миеломды жапысбаған жасушалардан бөліп алу болып табылады. Тышқандар сол антигенге қарсы антиденелер шығаратын белгілі бір антигенді енгізеді. Жасуша суспензиясын алу үшін тышқандардың көкбауыры алынып, гомогенизацияланады. Бұл суспензияда енгізілген антигенге қарсы антиденелер шығаратын В жасушалары бар. Содан кейін көкбауыр жасушалары культурада үздіксіз өсуге қабілетті миелома жасушаларымен араласады, сонымен қатар нуклеотидтер синтезінің резервтік жолы жоқ. Көкбауыр мен миелома жасушаларының кейбір антидене жасушалары гибридті жасушаларды қалыптастыру үшін біріктіріледі. Бұл гибридті жасушалар одан кейін культурада үздіксіз өсіп, антиденелер шығара алады Жасуша қоспасы тек гибридті жасушалардың өсуіне мүмкіндік беретін селективті ортаға орналастырылады. Біріктірілмеген миелома жасушалары мен лимфоциттер өледі. Гибридті жасушалар клон қалыптастыру үшін көбейеді. Гибридомалар қажетті антиденелердің өндірісі үшін тексеріледі. Содан кейін таңдалған будандар моноклоналды антиденелердің көп мөлшерін алу үшін өсіріледі. Моноклоналды антиденелері бар сұйықтықтың көп мөлшерін алу үшін гибридомаларды реципиент тышқандар ішіне енгізуге болады . Нәтижесінде іш қуысында қатты ісік пайда болады және моноклоналды антиденелердің көзі болып табылатын асциттік сұйықтық жиналады. Алынған клондарды -70С температурада мұздатуға және ұзақ уақыт сақтауға болады. Оларды дәріптеу және жинақтауға антиденелер культуральді ортаға, сондай-ақ тышқандарға егіп, олар өседі және үлкен санды моноклоналды антиденелер жинақталынады. Бір тышқаннан қояннан кем емес антиденелер алуға болады. Бұл антиденелерде сыртқы антиденелер жоқ және біркелкі болғандықтан, оларды таза химиялық реагенттер ретінде қарастыруға болады. Осылайша, моноклоналды антиденелердің (гибридоманың) клон-продуценттері иммунизацияланған жануардың лимфоидты тінінің антидене түзуші жасушалары мен плазмоцитома жасушаларының бірігуі арқылы алынады. Нәтижесінде алынған жасушалар лимфоциттерден антиденелер секрециясы қабілетін және миелома жасушаларынан in vitro шексіз өсу қабілетін мұра етеді. Гибридомалар иммунологияны төңкеріп, онда мүлдем жаңа аймақтар құрды. Гибридомалардың арқасында көптеген ауруларды диагностикалаудың жаңа әдістері пайда болды және қатерлі ісіктер мен көптеген ауруларды зерттеудің жаңа жолдары ашылды. Осыған байланысты моноклоналды антиденелер алған ғалымдар 1984 жылы Нобель сыйлығымен, көрнекті ашылулар үшін берілетін ең жоғары ғылыми марапатпен марапатталды. Гибридті алу схемасы (г. И. Абелев, 1998) А, В, С - иммундау үшін пайдаланылған антигендердің көп компонентті қоспасы (немесе көптеген антигендік детерминанттары бар күрделі антигендер);АКК-көкбауырдың антидене түзуші жасушалары;Селективті ГАТ - ортада өспейтін плазмоцитома жасушалары;ПЭГ-полиэтиленгликоль. Моноклоналды антиденелер қазіргі уақытта кеңінен қолданылатын диагностикалық агент ретінде өте ыңғайлы болды. Олардың көмегімен жасуша популяциясының маркерлері (қан жасушаларының және атап айтқанда лимфоциттердің фенотиптелуі), гормондар, медиаторлар, ісік маркерлері және т. б. анықталады. Моноклоналды антиденелерді қолдану салалары: адам лимфоциттерінің субпопуляцияларын анықтау жасушалық популяциялардың сарқылуын бақылау жасушалардың бөлінуі жасуша беті молекулаларының қызметін анықтау қан тобын анықтау ісіктердің диагностикасы және ісіктердің локализациясы иммунорадиометриялық талдау антигендердің күрделі қоспаларын талдау эмбриональды дамуды талдау иммундық реакцияны талдау Моноклоналды антиденелер бірқатар әдістерде кеңінен қолданылады: Агглютинация реакциясы Моноклоналды антиденелер (анти-А және анти-в цоликлондары) - эритроциттердің агглютиногендерін анықтау үшін қолданылады Иммуноферментті талдау Иммуноферменттік талдау (қысқаша ИФТ, ағылш. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) - антигендер мен антиденелерді сапалы анықтау мен сандық өлшеудің зертханалық иммунологиялық әдісі. ИФТ антиген мен оған сәйкес моноклоналды антидене арасындағы нақты өзара әрекеттесу принципіне негізделген. Қалыптасқан кешенді анықтау ферменттік белгімен біріктірілген анти-антидене болып табылатын конъюгат деп аталатын әдісті қолдана отырып жүзеге асырылады (әдетте желкек пероксидазасы қолданылады). Ағынды цитометрия әдісі Ағынды цитометрия әдісі жасуша параметрлерін, оның органеллаларын және ондағы процестерді тез оптикалық өлшеуге арналған. Лазер сәулесінің жарығы сұйықтық ағынында жасуша арқылы өтетін кезде жазылады, ал жарық дисперсиясының дәрежесі жасушаның мөлшері мен құрылымы туралы түсінік алуға мүмкіндік береді. жүктеу/скачать 1,48 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|