Қазақстан Республикасының білім және ғылым министрлігі Қостанай мемлекеттік педагогикалық институты
Бұлшықет тканіндегі липидтерді бөлу және сандық анықтау (Л. Кельман және Ю. Лясковский бойынша) (зертханалық жұмыс)
жүктеу/скачать 4,13 Mb.
|
| 1.5.4 Бұлшықет тканіндегі липидтерді бөлу және сандық анықтау (Л. Кельман және Ю. Лясковский бойынша) (зертханалық жұмыс)
Биологиялық материалдан липидтерді бөлу кезінде липидтердің тотығуы мен деградациясы жүріп, жанама өнімдер түзіледі. Сондықтан липидтерді бөліп алуды жылдам және жоғары температура, ауадағы оттегі, жарық, металдардың өте аз мөлшерімен ластану және т.б. факторлардың әсерін мүмкіндігінше болдырмайтын жағдайда жүргізу керек. Қазіргі кезде липидтерді жұмсақ жағдайларда бөлу және тазартудың тиімді, жылдам әдісі қолданылады. Экстракция үшін липопротеиндік комплекстерді бұзатын және сол арқылы липидтерді толығымен бөліп алуға мүмкіндік беретін метанол мен хлороформ қоспасы қолданылады. Қоспа мен ткань гомогенденеді де, тканьдегі сумен бір фазалы жүйе түзеді. Гомогенатқа хлороформ мен судың артық мөлшерін қоса отырып, оңай бөлуге болатын екі фазалы жүйе алынады. Хлороформ қабатында еріген липидтер болады, липидті емес қоспалар онда іс жүзінде жоқ. Метанол-су қабатында және ткань қалдығында липидтердің қалатын мөлшері мардымсыз. Құрал-жабдық және реактивтер: Шайқауға арналған аппарат; техникалық таразы; су моншасы; 105 0С-ты термостат немесе краны бар эксикатор (вакуумды, Р2О5 салынған); ет турағыш; қақпақтары бар полиэтилен ыдыстары немесе шлифтелген тығындары бар шыны банкалар; өлшеуге арналған шынылар; шпательдер (ұзындығы 150 мм); шыны таяқшалар; 100, 250 және 500 мл-лік өлшеуіш цилиндрлер; Бюхнер воронкасы (диаметрі 8 мм); Бунзен колбасы; су ағынды шыны насос; 500 мл-лік бөлгіш воронка; термометр; бюкстер; сүзгі қағазы; ет турағыш арқылы екі рет өткізілген ет; метанол; хлороформ; мырыш ацетаты (2 %-дық). Жұмыс барысы: Ұсақталған бұлшықет тканінен 30-40 г (0,01 г дәлдікпен) өлшеп алып, тығыз жабылатын қақпағы бар полиэтилен банкаға салады, үстіне 130 мл метанол құйып, біртекті масса түзілгенше араластырады және етті езеді. Содан кейін 65 мл хлороформ қосып, шайқағыш аппаратпен 10 минут сілкіп шайқайды (минутына 160-170 сілку). Оған тағы да 65 мл хлороформ қосып, 5 минут шайқайды. Қоспаға 65 мл 2 %-дық мырыш ацетаты ерітіндісін қосып, 30 секунд сілкіп араластырады. Ыдыс ішіндегісін сүзгі қағазы арқылы Бюхнер воронкасында аздаған қысыммен сүзеді, сүзу кезінде воронкадағы гомогенатқа CO2 не N2 ағынын жіберіп тұрған жөн. Сүзу аяғына қарай еріткішті неғұрлым толық кетіру үшін вакуум деңгейін арттырады. Воронкада қалған ет қалдығын сүзгі қағазымен және воронканы сүрткен сүзгі қағазының кішкене бөлігімен бірге шайқау ыдысына қайта салып, 100 мл хлороформмен 10 минуттай экстракциялайды. Мұны да алдыңғы колбаға сүзеді, ыдысты және ткань (ет) қалдығын 50 мл хлороформмен шайып сүзеді. Барлық фильтратты 500 мл-лік бөлгіш воронкаға жинап, тұндырады және сұйықтықтың 2 қабатын бір-бірінен бөледі. Бөліп алынған хлороформды сыйымдылығы 500 мл құрғақ өлшеуіш цилиндрге оның көлемін анықтау үшін құйып алады. Құрамында 200-300 мг липидтер болатын хлороформ қабатының аликвотты бөлігін тұрақты массаға дейін кептірілген бюкске ауыстырады және су моншасында (40-50 0С) толық құрғағанша буландырады (ауа тартатын шкафта). Липидтердің тотығуын болдырмау және кептіруді жылдамдату үшін буланып жатқан үлгіге азот ағынын жіберіп тұрған жөн. Буланғаннан кейін қалғанын тұрақты массаға дейін вакуум-эксикаторда фосфор (V) оксиді үстінде немесе 102-105 0С-ты кептіргіш шкафта кептіреді. Липидтердің массалық үлесін (%) келесі формула бойынша есептейді: С = Мұндағы a - липидтердің аликвотты порциядағы массасы, г; V – хлороформ қабатының жалпы көлемі, мл; V1 – хлороформның аликвотты порциясының көлемі, мл; m - бұлшықет тканінің массасы, г. Қосымша экстракциялау липидтердің шығымын арттырмайтыны анықталған. жүктеу/скачать 4,13 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|