СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БО МЕТОДАМИ МУТАГЕНЕЗА И СЕЛЕКЦИИ. КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ. МЕТОДЫ СОХРАНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

1. 
   Совершенствование бо методами мутагенеза и селекции.
   
2. 
   Клеточные технологии в медицине.
   
3. 
   Методы сохранения клеточных культур.
   

Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических.

Совершенствование биообъектов путем предварительного мутагенеза и последующей селекции оказалось гораздо более действенным. В этом случае разброс мутантов по выраженности признаков резко увеличивается. Среди них оказываются мутанты с пониженной способностью к реверсии, т.е. со стабильно измененным признаком. Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами.

Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Таким образом, после обработки биообъекта мутагенами их воздействие на ДНК приводит к частому наследственному изменению уже на уровне фенотипа. Последующей задачей является отбор и оценка нужных мутаций. Для их выявления обработанную культуру высеивают на твердые питательные среды разных составов, предварительно разведя ее с таким расчетом, чтобы на твердой среде не было сплошного роста, а формировались отдельные колонии, образуемые при размножении именно отдельных клеток. Затем каждую колонию пересеивают и полученную культуру (клон) проверяют по тем или иным признакам в сравнении с исходной. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка, хотя приемы, позволяющие повысить ее эффективность, постоянно совершенствуются.

Так, изменяя состав твердых питательных сред, на которых вырастают колонии, можно сразу получить первоначальные сведения о свойствах клеток этой колонии в сравнении с клетками исходной культуры. Для высеивания клонов с разными особенностями метаболизма используют так называемый «метод отпечатков», разработанный Дж. Ледербергом и Э. Ледерберг. Популяцию микробных клеток разводят так, чтобы на чашке Петри с питательной средой вырастало около 100 колоний, и они были бы четко разделены. На металлический цилиндр диаметром, близким к диаметру чашки Петри, надевают бархат; затем все стерилизуют, создавая, таким образом, «стерильное бархатное дно» цилиндра. Далее прикладывают это дно к поверхности среды в чашке с выросшими на ней колониями. При этом колонии как бы «отпечатываются» на бархате. Затем этот бархат прикладывают к поверхности сред разного состава. Таким образом можно установить: какая из колоний в исходной чашке соответствует мутанту, нуждающемуся в конкретном витамине, или конкретной аминокислоте; или какая колония состоит из мутантных клеток, способных к образованию фермента, окисляющего определенный субстрат; или какая колония состоит из клеток, получивших резистентность к тому или иному антибиотику и т.п.

В первую очередь интерес вызывают мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, наиболее перспективный в практическом отношении, может многократно обрабатываться разными мутагенами. Новые мутантные штаммы, получаемые в научных лабораториях разных стран мира, служат предметом обмена при творческом сотрудничестве, лицензионной продажи и т.п.

Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией) обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов в организме продуцента. Например, повышенную активность организма, образующего целевой продукт, можно ожидать, если мутация привела к дупликации (удвоению) или амплификации (умножению) структурных генов, включенных в систему синтеза целевого продукта. Далее активность можно повысить, если за счет разных типов мутаций будут подавлены функции репрессорных генов, регулирующих синтез целевого продукта. Весьма эффективный путь увеличения образования целевого продукта  нарушение системы ретроингибирования.

Помимо дупликации и амплификации структурных генов мутации могут носить характер делеции  «стирания», т.е. «выпадения» части генетического материала. Мутации могут быть обусловлены транспозицией или инверсией. При этом геном мутантного организма претерпевает изменения, ведущие в одних случаях к потере мутантом определенного признака, а в других  к возникновению у него нового признака.

Немалое значение для биотехнологического производства могут иметь и так называемые «точечные» мутации. В этом случае изменения происходят в пределах только одного гена.