Биологические науки казахстана свидетельство

41

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

ЛИТЕРАТУРА

1  Амиреев  С.А.  Эпидемиология:  Т.  2  / 

С.А. Амиреев. - Алматы,  2002. - 687 с.

2  Общая  и  частная  эпидемиология:  (ру-

ководство для врачей): Т. 2 / под ред.проф. 

И.И. Елкина. – Москва,1973. - С. 162.

3 Лекции по особоопасным инфекциям – 

ЦАРО СДС (США). -  Алматы, 2005.

4 Покровский В.И. Инфекционные болез-

ни и эпидемиология / В.И. Покровский, 

С.Г.  Пак,  Н.И.  Брико  и  др.  -  М.,  2005.  - 

811 с.

5  ГУ  «Департамент  Комитета  государ-

ственного  санитарно-эпидемиологического 

надзора  МЗ  РК  по  Павлодарской  обла-

сти»//http://pavlsanepid.gov.kz/content/

view/2/214?lang=ru

6  Кучерук  В.В.  Количественный  учет 

важнейших  видов  вредных  грызунов  и  зем-

лероек  /  В.В.Кучерук  //  Методы  учета  чис-

ленности  и  географического  распределения 

наземных позвоночных. - М., 1952. - С. 9-46.

7  Об  усилении  мероприятий  по  профи-

лактике  заболеваний  людей  туляремией  в 

Республике  Казахстан  //  Методические  ре-

комендации Министерства здравоохранения 

Республики Казахстан. - 2005.   

8 Постановление Правительства Рес-

публики Казахстан №1476 от 06.12.2011 

г.  «Об  утверждении  Санитарных  правил 

«Санитарно-эпидемиологические  требова-

ния к организации и проведению санитарно-

противоэпидемических (профилактических) 

мероприятий  по  предупреждению  особо-

опасных инфекционных заболеваний».

9 Амиреев С.А. Стандарты и алгоритмы 

мероприятий при инфекционных болезнях / 

С.А.  Амиреев,  Т.А.  Муминов,  Б.А.  Черкас-

ский и др. – Алматы, 2007. – Т. 1. - 

С. 242-263. 

10 Амиреев С.А. Стандарты и алгоритмы 

мероприятий  при инфекционных болезнях / 

С.А.  Амиреев,  Т.А.  Муминов,  Б.А.  Черкас-

ский и др. – Алматы, 2007. - Т. 2 - С.170-284.

11  Приказ  Министерства  здравоохране-

ния от 16.08.2004 № 616 * «Об утверждении 

инструкции по проведению санитарно - про-

тивоэпидемических 

(профилактических) 

мероприятий  по  туляремии  в  Республике 

Казахстан» / http://kazakhstan.news-city.info/

docs/sistemsa/dok_ieyzdz.htm

Location of a positive find 

Studied material

Quantity of positive 

results

Pavlodar district Kenzhekol village

Dermacentor 

marginatus ticks

1

Pavlodar district Kenzhekol village

Microtus gregalis

1

Pavlodar district Kenzhekol village

Clethrionomys 

rutilus

1

Pavlodar district  Aitim village

D. marginatus ticks

8

Pavlodar city

D. marginatus ticks

1

Zhelezinsky district Zhelezinka village

water

1

Zhelezinsky district Zhelezinka village

Microtus gregalis

1

Zhelezinsky district   Моiseevka village

water

1

Zhelezinka district,   Pyatiryzhsk village

water

2

Shcherbakty district   Zhyly-Bulak village

Microtus oecono-

mus

2

Shcherbakty district   Zhyly-Bulak village

Haemaphysalis 

concinna ticks

16

Shcherbakty district,   Kolbulak village

Apodemus uralensis

1

Lebyazhie district,   Malybay village  

H.concinna ticks

1

Lebyazhie district ,  Kazy village

Sorex araneus

1

Aktogay district, Aktogay village

  Kozhamzhar village

Excrements of 

carnivores

2

Table 2. Positive tests on a tularemia revealed by the IFA method in 

2012 

42

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

УДК 619:576.895.132

А.Э. Кучбоев, Д.К. Умаров, Р.Р. Каримова, Б.Х. Рузиев, Г.Д. Хайдарова

Институт генофонда растительного и животного мира АН РУз, Ташкент

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕГОЧНЫХ НЕМАТОД - 

ПАРАЗИТОВ ЖИВОТНЫХ УЗБЕКИСТАНА 

Жүргізілген морфологиялық және 

молекулалық  зерттеулер  нәти-

жесінде  Өзбекстан  жануарла-

рында 

өкпе 

нематодтарының   

9  түрі  анықталды:  Protostrongylus 

rufescens, 

P.hobmaieri, 

Proto-

strongylus 

sp., 

Spiculocaulus 

leuckarti, 

Cystocaulus 

ocreatus 

(Protostrongylidae),  Metastrongylus 

elongatus, 

M. 

pudentotectus,   

M.  salmi  (Metastrongylidae)  және 

Dictyocaulus  filaria  (Dictyocaulidae). 

Сонымен 

қатар 

ағзасында 

протостронгилидтердің  2  және   

3  сатыдағы  дернәсілдері  дамитын 

Xeropicta сandaсharia жер бетіндегі 

моллюскалары зерттелді.

В  результате  проведенных  мор-

фологических и молекулярных иссле-

дований  у  животных  Узбекистана 

выявлено 9 видов легочных нематод: 

Protostrongylus rufescens, P.hobmaieri, 

Protostrongylus  sp.,  Spiculocaulus 

leuckarti, 

Cystocaulus 

ocreatus 

(Protostrongylidae),  Metastrongylus 

elongatus, M. pudentotectus, M. salmi 

(Metastrongylidae)  и  Dictyocaulus 

filaria  (Dictyocaulidae).  Также  ис-

следованы  наземные  моллюски 

Xeropicta  сandaсharia,  в  организме 

которых развиваются личинки про-

тостронгилид 2 и 3 стадий.

The  result  of  the  morphological 

and  molecular  studies  of  animals 

of  Uzbekistan  have  revealed  9 

species  of  lung  nematodes,  they 

Введение

Нематоды семейств Protostrongylidae, 

Dictyocaulidae и Metastrongylidae отно-

сятся к подотряду Strongylata Railliet et 

Henry, 1913. Они широко распростране-

ны  и  представлены  в  качестве  патоге-

нов  биоразнообразия  у  различных  ви-

дов  позвоночных  животных  -  обитате-

лей водных и наземных экосистем. Хотя 

эти нематоды представляют важные па-

тогенные агенты домашних и диких жи-

вотных, мы продолжаем ощущать огра-

ниченное знание их молекулярной фи-

логении и эволюционных аспектов в си-

стеме  «паразит-хозяин».  Нематоды  се-

мейств  протостронгилид,  диктиокау-

лид и метастронгилид состоят из более 

80  видов  мировой  фауны,  адаптирова-

лись к паразитированию в органах ды-

хания,  главным  образом,  парнокопыт-

ных, часть которых оказались дефини-

тивными  хозяевами  рассматриваемых 

гельминтов[1].

В  Узбекистане  у  диких  и  домаш-

них  парнокопытных  зарегистрирова-

но 22 вида легочных нематод [1, 2, 3], 

паразитирующих  в  дыхательных  пу-

тях.  Видовое  разнообразие  смешан-

ных  инвазий  состоит  из  представите-

лей родов Metastrongylus, Dictyocaulus, 

43

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

генетического  анализа.  Анализ  струк-

туры  ДНК,  наряду  с  традиционными 

методами  исследования,  стал  неотъем-

лемой  частью  комплексного  подхода  к 

решению  многих  биологических  про-

блем. В этом плане  заслуживает  осо-

бое  внимание  использование  в  ис-

следованиях  полимеразной  цепной 

реакции  (ПЦР).  Метод  ПЦР  направ-

лен  на  выявление  легочных  парази-

тов и использован для исследования 

образцов  ДНК  даже  по  фекальным 

пробам.

Нашей  задачей  было  сравнитель-

ное  изучение  видов  легочных  нема-

тод  животных  с  целью  определения 

различий  между  ними  и  получения 

дополнительных данных о строении 

рибосомальной ДНК паразитов.

Материал и методы

Сбор материала. Материалом дан-

ной работы послужил анализ резуль-

татов исследований по изучению фа-

уны,  морфологии  и  молекулярной 

биологии  видов  нематод  семейства 

Protostrongylidae, 

Dictyocaulidae 

and  Metastrongylidae  паразитов  жи-

вотных  Узбекистана.  Гельминтоло-

гический  материал  от  диких  (Capra 

sibirica,  C.  falconeri,  Ovis  vignei, 

Ovis  ammon  и  Sus  scrofa)  и  домаш-

них  животных  (C.  hircus  и  O.aries) 

Caprinae и сбор наземных моллюсков 

Xeropicta  candaсharica  проводился  в 

предгорно-горных  зонах  Узбекиста-

на и сопредельных территорий. 

Морфологическое  изучение.  При 

изучении видового состава и морфо-

Protostrongylus, Muellerius и Cystocaulus. 

Практически  виды  указанных  родов  и 

составляют  ядро  доминирующих  не-

матод  в  биогеоценозах  Узбекистана,  а 

остальные виды регистрируются очень 

редко. Возбудителями болезней являют-

ся метастронгилы, диктиокаулы, прото-

стронгилы, цистокаулы и мюллерии.

В  биологическом  цикле  развития 

протостронгилид  участвуют  промежу-

точные  хозяева  –  наземные  моллюски 

десяти  родов:  Vallonia,  Gibbulinopsis, 

Pupilla,  Pseudonapaeus,  Bradybaena, 

Leucozonella,  Xeropicta,  Candaharia, 

Macrochlamys,Succinea, в организме ко-

торых развиваются личинки II и III ста-

дий  [3],  a  у  метастронгилид  протекает 

при  участии  промежуточных  хозяев  – 

различных видов дождевых червей [1].

В  настоящее  время  практически  ни 

одно  исследование,  связанное  с  реше-

нием вопросов филогении и системати-

ки, изучением внутривидовой и популя-

ционной структуры видов, не обходится 

без  применения  методов  молекулярно-

are 

Protostrongylus 

rufescens, 

P.hobmaieri,  Protostrongylus  sp., 

Spiculocaulus  leuckarti,  Cystocaulus 

ocreatus  (Protostrongylidae),  Metast-

rongylus elongatus, M. pudentotectus, 

M.  salmi  (Metastrongylidae)  и 

Dictyocaulus  filaria  (Dictyocaulidae). 

Also  studied  terrestrial  mollusk 

Xeropicta  candacharica,  in  the  foot 

which develop larvae of protostrongylid 

of 2 and 3 stages.

Ключевые  слова:  животные,  ле-

гочные нематоды, протостронгили-

ды,  наземные  моллюски,  молекуляр-

ные исследования.

44

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

Выделение  ДНК  и  амплификация. 

Частичные  нуклеотидные  последо-

вательности  рибосомной  ДНК  (18S) 

были использованы для исследования 

филогенетических  и  эволюционных 

взаимосвязей  протостронгилид.  При 

этом была выделена рДНК при помо-

щи Набора Genomic DNA from Tissue 

(Германия) и дважды промыта в 100µl 

буфера AE, имеющегося в данном на-

боре. При определении последователь-

ности участков ITS 2 рДНК с помощью 

ПЦР (Touchgene Gradient, UK) исполь-

зован праймеров 5 pmol праймеров 18S 

(forward;  5`-  AGGTCTGGTTCAGG 

GTTG-3`) и (reverse; 5`- TTFGTTTCTT 

TTGGTCCCCT-3`), 0.2 U Phusion DNA 

Polymerase,  4  nmol  dNTP  mix  и  2  µl 

матрицы  в  20  µl  реакции  [98ºC  в  те-

чение 30 cекунд, 40 x (98ºC в течение 

10 секунд, 55ºC 30 секунд, 72ºC в те-

чение  30  секунд),  72ºC  в  течение  10 

минут].  Электрофорез  амплифициро-

ванных фрагментов ДНК проводили в 

1.5%  агарозном  геле  в  1хTAE-буфере 

и 5 мкг/мл бромистого этидиума и фо-

тографировали  в  системе  гель  доку-

ментирования  BOX  SYNGENE.  Раз-

мер  полученного  ПЦР  продукта  опре-

деляли путем сравнения с фрагментами 

ДНК маркера GeneRulerTM 100 bp DNA 

Ladder 100-1000 п.н. (рис. 3).

Результаты

В результате паразитологических ис-

следований  домашних  и  диких  живот-

ных обнаружены половозрелые немато-

ды  9  видов, в том числе из семейства про-

логии  протостронгилид  использова-

лись общепринятые методы С.Н. Бо-

ева [4], Anderson [5, 6] и Контрима-

вичус и др.[7].

Для  морфологического  изуче-

ния  личинок  третьей  стадии  прото-

стронгилид  у  зараженных  моллю-

сков Xeropicta candaсharica отделяли 

ножки и помещали их в искусствен-

ный  желудочный  сок.  В  этой  сре-

де  разрушался  чехлик  (панцирь)  и 

освобождались  инвазионные  личин-

ки.  Они  располагались  в  тканях  но-

жек  в  свернутом  виде.  Из-за  слож-

ности  определения  вида  и  диффе-

ренциации этих личинок мы провели 

молекулярные исследования.

Личинок  I  стадии  изучали  пу-

тём  исследования  проб  фекалий  ди-

ких  и  домашних  животных.  При 

этом  учитывались  отличительные 

морфологические  признаки  для  про-

тостронгилид:  личинки  без  дорсаль-

ного  кутикулярного  шипа  у  вершины 

хвоста  (для  видов  Protostrongylinae) 

и  личинки  с  шипом  (для  видов 

Muelleriinae,Varestrongylinae  и  др.),  а 

также  длина  и  форма  хвоста  и,  кро-

ме  того,  размеры  тела  личинки.    По-

сле определения видовой принадлеж-

ности  половозрелых  нематод  и  личи-

нок  протостронгилид  (родовой  -  для 

личинок первой и третьей стадий) ма-

териал хранился в отдельных пробир-

ках с молекулярной водой при низких 

температурах (-20°С) или в 70º этано-

ле для молекулярного анализа.

45

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

Pиcунoк 1 - Микрофотография личинки I стадии Protostrongylus sp. 

Pиcунoк 2 - Инвазионная личинка Protostrongylus sp., извлеченная от ноги 

моллюска Xeropicta сandaсharica (Увеличение 400×).

a – головной конец; б – пищеводно-кишечный переход; в – нервное кольцо;  

г – экскреторное отверстие; д – кишечник; д – половой зачаток;  

ж – анус; з – хвост (Оригинал). Увеличение 400×

46

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

тостронгилид: Protostrongylus rufescens 

(Leuckart,  1865),  P.  hobmaieri  Cameron, 

1934,  Spiculocaulus  leuckarti  Schulz, 

Orlow  et  Kutass,  1933  и  Cystocaulus 

ocreatus (Railliet and Henry, 1908), из ме-

тастронгилид:  Metastrongylus  elongatus 

(Dujardin,  1846),  M.  pudentotectus 

(Wostokov,  1905)  и  M.  salmi  (Gedoelst, 

1923)  и  из  семейства  диктиокаулид: 

Dictyocaulus filaria (Rudolphi, 1809).

Изучено  морфологическое  строение 

личинок  первой  стадии  Protostrongylus 

sp., выделенных из фекалий коз (рис. 1). 

Указанные  личинки  характеризуются 

отсутствием  дорзального  кутикулярно-

го шипа у вершины хвоста. 

На  рисунке  2  представлена  личинка 

третьей стадии с темно-коричневым ре-

бровидным чехликом, изолированная из 

моллюска X. сandaсharica. 

Окончательная  дифференциация  ли-

чинок  третьей  стадии  осуществляет-

ся  после  формирования  чехлика.  Уста-

новленный  факт  является  важной  осо-

бенностью  с  эпизоотологической  точ-

ки зрения, так как указанные морфоло-

гические изменения личинок не закон-

чены  и  не  могут  свидетельствовать  об 

их способности инвазирования дефини-

тивного  хозяина.  После  освобождения 

от чехлика личинка малоподвижна, а ее 

внутренняя  структура  аналогична  дру-

М-маркер; 1 - Protostrongylus rufescens; 2 - P.hobmaieri;  

3 - Spiculocaulus leuckarti; 4 - Cystocaulus ocreatus; 5- Protostrongylus sp.;  

6 - Metastrongylus elongatus; 7 - M. pudentotectus;  

8 - M. salmi; 9 - Dictyocaulus filaria;  

Р - позитив контроль (Haemonchus contortus)  

и N – негатив контроль (вода), п.н. – пар нуклеотидов.

Pиcунoк 3 - Геномная вариабельность легочных нематод, выявленная с помощью 

праймеров ITS-2 региона. 

47

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ КАЗАХСТАНА №1, 2013

гим  видам  инвазионных  личинок  про-

тостронгилид.

С использованием ПЦР были получе-

ны  нуклеотидные  последовательности 

ITS-2 региона от 8 видов половозрелых 

легочных нематод и по одному образцу 

- от личинок первой и третьей стадий. 

Выявлено, что нематоды Protostrongylus 

rufescens  и  P.hobmaieri  состави-

ли  около  380  пар  нуклеотидов  (п.н.), 

Spiculocaulus leuckarti - 388, Cystocaulus 

ocreatus – 399, Metastrongylus elongatus, 

M. pudentotectus и M. salmi,  около 490, а 

у Dictyocaulus filaria – около 510 п.н. Ли-

чинки  третьей  стадии,  выделенные  из 

моллюсков X. сandaсharica, имели оди-

наковый  молекулярный  размер,  анало-

гичный  видам  нематод  Protostrongylus 

и составили  380 п.н. Личинки первой 

стадии  (без  кутикулярного  шипика  у 

вершины хвоста), выделенные из фека-

лий коз, имели около 400 п.н. (рис. 3). 

Эти личинки, по-видимому, относились 

к другому виду рода Protostrongylus sp. 

Для  уточнения  этих  предположений 

продолжается  секвенирование  нукле-

отидных  последовательностей.  Кроме 

того, полученные нуклеотидные после-

довательности  ITS-2  видов  были  срав-

нены  с  известными  видами  из  Цен-

тральной Азии Protostrongylus rufescens 

(EU018485)  и  Cystocaulus  ocreatus 

(EU018481) [8].

Таким образом, по результатам прове-

денных паразитологических исследова-

ний животных Узбекистана выявлено 9 

видов протостронгилид: Protostrongylus 

rufescens,  P.  hobmaieri,  Protostrongylus 

sp.,  Spiculocaulus  leuckarti,  Cystocaulus 

ocreatus,  Metastrongylus  elongatus,  M. 

pudentotectus,  M.  salmi  и  Dictyocaulus 

filaria.  Морфологический  и  моле-

кулярно-генетический анализ выявлен-

ных нематод позволил провести их точ-

ную  видовую  идентификацию  и  спо-

собствовал  уточнению  пространствен-

ного распределения паразитов.

ЛИТЕРАТУРА

1 Кучбоев А.Э. Фауна и экология нематод отря-

да Pseudaliida Azimov, 1998 – эндопаразитов млеко-

питающих / А.Э. Кучбоев, Б.Х. Рузиев, Д.А. Азимов 

и др. // Узбекский биологический журнал. - 2010. - № 

3. - С.58-63.

2  Кулмаматов  Э.Н.  Гельминты  позвоночных 

горных экосистем Узбекистана / Э.Н. Кулмаматов, 

Д.Т. Исакова, Д.А. Азимов. - Ташкент: Фан, 1994. - 

151с.

3 Кучбоев А.Э. Популяционная экология, систе-

матика  нематод  семейства  Protostrongylidae  Leiper, 

1926 и функционально-метаболические процессы в 

системе “паразит-хозяин: автореф.дис. ... док. биол. 

наук  / А.Э. Кучбоев. - Ташкент, 2009. - 43 с. 

4 Боев С.Н. Основы нематодологии. Протострон-

гилиды / С.Н. Боев. -  М.: Наука, 1975. – Т.25. – 266 с.

5  Контримавичус  В.Л.  Основы  нематодологии.

Метастронгилоидеи домашних и диких животных / 

В.Л.Контримавичус, С.Л.Делямуре, С.Н. Боев. - М.: 

Наука, 1976. – Т. 26. – С.239 

6  Anderson  C.  Key  to  genera  of  the  superfamily 

Metastrongyloidea. - No. 5. In CIN Keys to the nematode 

parasites  of  vertebrates,  R.C.Anderson,  A.G.Chabaud, 

and  S.Willmott  (eds.).  Commonwealth  Agricultural 

Bureaux, Farnham Royal, UK. 1978. – Р. 1-40.

7 Anderson C. Nematode parasites of vertebrates: 

their  development  and  transmission  /  С.Anderson..  -  

CAB International, 2000. – Р. 650 

8  Kutz  S.J.  Serendipitous  discovery  of  a  novel 

protostrongylid 

(Nematoda: 

Metastrongyloidea) 

in  caribou  (Rangifer  tarandus),  muskoxen  (Ovibos 

moschatus) and moose (Alces alces) from high latitudes 

of North America based on DNA sequence comparisons 

/  S.J.Kutz  ,  I.Asmundsson,  E.P.Hoberg  //  Canadian 

Journal of Zoology. - 2007. – 85. (11). – P. 1143-115 6.

жүктеу/скачать 3,44 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: