Биотехнология
жүктеу/скачать 11,01 Mb. Pdf көрінісі
|
64 будандастьфуға тура келеді. Бұл жүмыс көп жылдарды қам- тиды (Г.Ж. Валиханова, 1996 ж.). Өсімдіктердің жасушалары мен тіндерін өсіру әдістерін і п у і і г о жағдайьшда меңгеру бүтіндей өсімдіктердің агротех- нологиясындағы жетістіктердщ таоысты жетшдіруі мен әрі қарай дамуының негізі болды. Өсімдіктердің әртүрлі сомалық жасушаларын өсіру мүмкіндігі және бүл жасушалардың тотипотенттігі будандасудың жаңа тәсілінің - жыныссыздық будандасу немесе сомалық гибридизаңияның пайда болуын тудырды. Тотипотенттік (лат. іоіт - бүкіл, түтас; роіепііо - күш) - муын қамтамасыз ететін жасушапардың өзіне тән генетика- лық ақпараты олардың толық түрде іске асыра алатын қасиеп. Әдетте әмбебапты тотипотенттікке өсімдіктер мен жануар- лардың үрықтанған жүмыртқалары ие. Сомалық жасушаларға келетін болсақ, тотипотенттікке іп чііго жағдайында өсімдік жасушаларының бейімдігі басым. Сомалық гибридизаңия өсімдіктер селекңиясында жасу- шалық технологияларды қолдану нәтижесі есебінде ата-ана- лық жасушалар арасында жыныстық сыйымсыздығы кедергі- сін жеңуге мүмкіндік берді, гибридтық клеткалар генетикальщ материалының әртүрлігін шүғыл кеңейтті. Ал генетикалық әртүрлілік - өсімдіктердің жаңа сүрыптарын алудың көзі; гибридтік жасушалардың генотиптік және фенотиптік сипат- тамасынан айырмашылығы артқан сайын, солғүрлым түпкі мақсатында жаңа сүрыпты алуға қол жеткізу мүмкіндігі көп. Егер дәстүрлі биотехнологияда немесе агротехнологияда түтас өсімдік нысаны болса, онда жасуша селекңиясы әдіс- терінің дамуы биотехнологиялық нысаиа есебінде өсімдіктер жасушалары мен тіндер культурасын пайдалануға мүмкіндік бер д і. Каллус - дифференцацияланбаған клеткалардан түратын бытыраңқы пролиферациялық тін. Каллус іп тіго өсімдік тін- дерінің бөлінген кейінділерінде (эксплант) немесе өсімдік зақымданған жерінде пайда болуы мүмкін. Каллустық жасу- шалардың культураларын іп шіго жағдайында колбалар, 65 флакон, Петри тоетағаншаларда қоректік ортада өсімдіктер тіндерінін жеке фрагменттерін (экспланттар) өсіру жолымен алады (11-сурет). Тамыр, сабақ тіндерінің немесе жапырақ мезофилінің экс- планттанған жасушалары қоректік ортада (тұздардың, көмірсу қоры, витаминдер және гормон тәрізді заттардың төмен кон- центрациясы бар) жетілдірілуін тоқтатады, яғни өсімдікте олардын арнайы қызметтеріне тән қүрылымын көрсетпейді; олар бөлінуге козады (индукцияланады). сөйтіп алғашқы кал- лус түзеледі. Калл\стық тін аморфты және нақты анатомия- льщ қүрылысы жоқ, бірақ ол тегіне және өсу жағдайына бай- ланысты әртүрлі консистенциялы болуы мүмкін: тым сулан- ған жасушалардан түратын былжыр; жаксы бөлінетін мерис- темалық ошакты орташа тығызды; камбий элементтері мен өткізгіш жүйесі жетілген тығыз). Каллустық жасушалар үлкен генетикалык гетерогендігі- мен (әртүрлі плоидты, хромосомалар саны айырмашьшыкты) және физиологиялык ерекшеліктерімен өзгешеленеді. Гене- 11 сурет. Ж апы рақ дискілерінін каллусынан өсім діггерді селективтік ортада регенерациялау. 66 гикалы гетерогенді кшілустық жасушалар фитопагогендерге. күизелісткк жағдаиларга жоне пайдалы м паоолиттердін жоғары синтеііне теіім ді жасуша селекциясы үшін жаксы матерщад болады. ^ Өсімдіктердің жасушалары мен тіндері культуртлы іп уітго жағдайында есімдікхер биотехнологиясы дамуынын жана зталы болып сипагталады, ол мынадай себептсрмен: - дәстүрлік селекциядан айырмашылыгы әжеитоуір кыска мезгілде жоғары онімділігі жоне жағымсыз факторларка (фитопатогендерге, түздаиуга, г.б.) гөзімділігі қабатгасуымсн сипатталатын өсімдікгср регснеранттарды алу мүмкіндігі; - өндірістік жағдайларда өсірілетін жасушалар керекті биологиялы белсенді қосылыстардын сиитезі мен аріан суб- стратты ақырғы өнімге биотрансформациялауға кабілетті, жасуша метаболизмі мен онын ретгелуін, бүтін есімдіктін өсуі мен дамуын зергтеу үшін үлгі болып табылады; - өсімдіктер жасушаларыньің культурасы жекелеген абио- тикалық және биотикалык экзогендік факторлар немесе түп- кілікті метаболит синтезі, өнімділігіне олардың бірігіп жаса- ған әсерін зерттеуге мүмкіндік береді және де бнопродуцент- тердін генетикасы мен физиологиясын зерттейді; - өсірудің іп у і і г о жағдайларында төтенше факторларға төзімділігі жөнінде ғана емес, ақуыздар аминкышкылдары жөне басқа метаболиттердін аса күшті өнімділігі жөнінде де жасуша деңгейінде селекция жүргізеді. Жалпы алғанда өсімдіктердің өсірілген жасушалары мен тіндері биотехнологияда кажет (12, 13-суреттер): - медицина, парфюмерия, косметика және басқа салалар үшін керекгі алкалоидтар, стероидтар, гликозидтер, фитогор- мондар, эфир майларының және баска заттардың продуцент- тері. Аталмыш заттарды көбінесе қатты (агарланған) немесе сүйық (суспензияланған) қоректік ортада өсірілген каллустык тіннен алады; - клоналдық микрокөбейту (меристемадан жылына 100000 дейін өсімдік-ретенеранттарды алуға болады) жолы- материалды көоеиту мен сауықтыру тіндердщ культуралары; 67 іп у і і г о жағдайында жасушалар мен тіндер жасушалық масса і X өнімдердің биотранс биосинтезі формация клоналдык көбейту және сауықтыру 12-сурет. Өсімдіктердің өсірілген жасутиалары мен тіндер негізіндегі технологиялар ( Г.Ж. Валиханова, 1996 ж.) Медицина Агроөндірістік кешен Химиялық өнеркәсіп 4 і і Дәрілік препарат- тарды өндіру Ауылшаруашылық биотехнология Биомассадан химиялык заттарды алу, химиялык ППРПЯПЯТТЯП ЛП%ІН ІІІА^ІІиии 1 1 цЦДРЩ биоскринингі і н 4 4 Өсімдіктерді көбейту мен сауықтьфу Өсімдіктерді генетикалық жақсарту Г енофондты сактау 13-сурет. Жасуша культураларын қолдану. 68 протопластгарды біріктіру :н құрғақшылыққа, тұздануға, фито күйзелістік факторларға төзімді осім пін бөлінген жасушалар. Жасушалар да өсіргенде бүтін өсімдіктер үшін қосымша метаболизмнің белгілі заттарымен қатар алкалоидтар, терпеноидтар, глико- зидтер, полифенолдар, полисахаридтер, эфир майлары топ- тары, одан басқа протеазалардың белсенділігін, фитовирус- тардың репродукциясын басатын жаңа қосылыстары табыл- ғанын баса көрсету қажет (7-кесте). 7-кесте Өсімдіктер жасушалары мен тіндерінің культурасында іп у і і г о ж а ғ д а й ы н д а и д е н т и ф и к а ц и я л а н ғ а н қосылыстардың әртүрлілігі Г Өсімдік түрі Идентификацияланған Атт. уізпа^а 1 Виснагин А ігора Ъеііасіоппа | Атропин, гиосциамин | СатрШһеса аситіпаіе Саззіа іога Саіагапіһиз гозеиз (Уіпса гозеа) Камтотецин Антрахинон Аймалицин, серпентин және басқа көптеген индолдық алколоидтар; олардың бірталайы бастапқы өсімдікте жоқ Серһаіоіахиз һаггіп%іопіа СоіТеа агаһіса Соіеиз Ыитеі Сорііз іаропіса Цефалотаксин, хорингтонин Стигмастерол, кампестерол, ситостерол, кофеин, теобромин Розмарин қышқылы Берберин, пальмитин, коптисин, ятрорицин, магнофлорин Оаіига зігстгопіит (немесе іппохіа) тропандық алкалоидтар Оіазсогеа ригригеа (немесе Іапаіа) Антрахинондар 69 Оіазсогеае сіеһоігіе Стигмастерол, холестерин, ситостерол және басқа көптеген стероидтар Кардиотоникалык гетерозидтер Ерһесіга/оііаіа (немесе %егаЫіапа) Диосгенинді қамтитын стероидтық сапониндер Нуозсуатиз пі§ег Эфедрин Г иосциомиқ скополамин және басқа алкалоидтар Шиконин және баска пигменттер Ыіһозрегтит егуіһгогһігоп Масіеауа тісгосаг Маігісагіа сатотіііа Протопин, алокриптин Эфирлік майлар Шсоііапа іаһасит Никотин және басқа алкалоидтар, убихинон-10 және басқа әртүрлі хинондар (кластохинон, токоферол, витамин К) Рапах £іп$еп£ Глутатиоқ фенолдық қосылыстар (скополетин), көптеген стероидтар (стигмастерол, ситостерол, кампестерол, холестерин, диосгенин) көпгеген ферментгер (фосфодиэстераза) Г инсеносидтар Т ебалин және басқа алкалоидтар Рарауег Ьгасіеаіит Рарауег зотпі/егит Кодеиқ морфиқ тебаиқ папавериқ наркотиқ нарцеиқ протопиқ сангинарин және басқа әртүрлі ажалоидтар МтшЩш зегрепііпе Резерпиқ ресциамин Алкалоидтар (рутакридоқ әртүрлі метилакридондар), фенолдьщ қосылыстар (бергаптеқ псорален), эфирлік майлар, пигменттер Киіа ШщёшШт Сонымен бірге өсімдіктердің жасушалары мен тіндерін өсіргенде, кейде зертханалық жағдайларда селекция жолы- мен қол жеткен нәтнжелердің тұрақсыздығы көрініс береді. Кейін тұздануға немесе фнтопатогендердің уытгарына төзімді 70 клондардан алынған өсімдж-регенерантгары бұл қасиетті кей- де сақтамайды. Яғни, жасуша культурасы жөне бүтін өсім- дік деңгейінде іске асатын резистенттік (шыдамдылықтың) факторлар механизмдері әртүрлі жөне өсімдікке енгізілген мақсаттық белгіні түрақтандыру жөнінде өрі қарай зерттеу- лер қажет. Бүл бағытта өсіретін ортада селективтік фактор- дың - фитопатоген уыттығын, түздардың конңентрация саны- ның, т.б. — концентрациясын біртіндеп арттыру жолымен сус- пензиялық культурадан, каллустық тіннен, протопластылар- дан мақсатты белгі бойынша жасушалар культурасы бір — және көп сатылы сұрыптауды жетілдіреді. Жасушалардың баяу өсуі (өсімдік жасушасының еселенуі 1-3 тәулік бойы болады, бұл бактериялық жасушаларға қара- ғанда 60-80 есе ұзақ), олардың өсу уақытының үзақтығы (2- 3 апта), өсу кезінде асептикалық жағдайларды сақтау керек- тігі, ақырғы өнімнің өсірілген ортада төмен мөлшерлігі, прока- риоттық жасушаға қарағанда, өсімдік жасушаларының меха- никалық зақымдануға сезімталдығы, өсімдіктердің жасуша- лық культураларын қеңінен қолдануға бөгет жасайды. Өсімдіктер жасушаларының көлемі бактерия және өңез жасушаларынан ондаған және жүздеген есе артық. Өсімдік жасушаларының көлемі онтогенезде елеулі өзгереді - егер өсу- дің экспоненциалдық фазасының басында олар үсақ жөне тығыз болса, өсудің стационарлық фазасында олар ірі және вакуо- лизденғен, өсіргенде зақымдануы оңай. Өсімдік жасушалары культурасының жасушалық селек- циясында талапқа сай биотехнологиялығы, олардың бірнеше қоректік ортада өсу мен көбеюге қабілеттілігінен, гормондар бойынша прототрофтығына, осмостық, механикалық күйзе- ліске төзімділігін және әрине, жоғары өнімділігінен түрады. Мысалы, раувольфия каллустық жасушаларын жылан эти- ленаминмен өндеу антиаритмиялық алкалоид аймалиннің өте жоғары мөлшерімен ерекшеленетін жасуша линиясын алуға мүмкіндік береді (бүтін өсімдіктің өнімділігімен салыстырғанда 10 есе артық). Өсімдік тіндерінің культурасын өндірісте қол- дану жөнінде мәліметтер келтірілген (8-кестеде). 71 Өнім Гликонин Убихинон-10 Аймалицин Камптотецин Берберин Антоциан 8-кесте Өсімдік тіндері Өсімдік Дәріханалық торғай шөп Т емекі Қызғылт қабыр шөп Үшкір ұшты камптотека Қолдану Күйік, жара, тері аурулары Жүрек аурулары Жапондық контис Г үлдер жинағы, жүзім Гипотензиялық дәрі Ісікке қарсы емдік дәрі Бактерицидгік зат, ішек бүлінуде қолданылады Пигмент Өсімдіктер жасуша биотехнологиясының өз алдына ныса- нына протопластылар жатады. Протопласт (ргоіоз — алғашқы, бірінші, рШоз-тузелтъщ қалыптанған) — бүл жасуша қабыр- ғасынан айрылған, цитоплазмалық мембранамен шектелген жасуша, ол толық метаболиттік үдеріс, оның ішінде биосин- тездік және биотрансформациялайтын қызметтер бар, бар- лық ішкі органоидтарға ие. Протопластылар бөтен ДНК үшін қолайлы реципиент болады, жасуша қабырғасы жоқ болған- дықтан олар әжептә) ір оңай бірігеді, сол себепті жаңа гено- фенотиптік белгілері бар гибридтер түзейді. Гаплоидтық өсім- діктердің протопластылары әртүрлі мутациялардың популя- циясында ерекше болашағы бар. Протопластылар келесі әдістермен алынады: 1) Механикалық плазмолиз жолымен. Бүл өсімдік жасуша- сының қатты қабатынан цитоплазманың қабырғалық қабатын бөлшектеу, бүл үшін өсімдік тінінің бөлігін цитоплазмалық сүйықтықтан жоғары концентрациялы ерітіндіге салады. Жоғары концентрациялы қоршаған ерітіндіге жасушадан су шыққанда, жасуша қабырғасы сіреспелі (қатты) қүрылым есе- бінде пішінін сақтайды, ал цитоплазмалық мембрана жасуша ішіне қарай жиырылады, бірақ жасуша тіршілік қабілетін сақтайды; 2) Химиялық жолмен - өсімдіктердің жасуша қабырға қүра- мын бүзатын ферменттер - целлюлаза, гемицеллюлазалар және 72 пектиназаларды қолданып. Жасуша қабырғасын бұзу меха- никалық зақымданудан цитоплазмалық мембрананы қорғай- тын осмостық тұрақтандыратын ортада (сахароза, сорбит, т.б.) жүргізіледі. Протопластыларды өсімдік жасушасы өсуінің логарифмдік фазасында бөліп алғанды дүрыс деп есептейді. Бүл фазада жасушалық қабырға энзимдік бүзылуға көп жеңіл- дірек жүргізіледі, ал протопластылар - өте жоғары тіршілікке қабілетті. Протопластыларды алу нәтижесі өсімдік тінінің типіне де (жапырақ, дән жарнағы, тамыр, каллустық тін, жасушалық суспензия), өсімдік түрі мен сүрыпына да тәуелді. Түрлік ерек- шеліктер, өсімдік тінінің морфофизиологиялық күйі, яғни оның генофенотиптік сипаттамалары тіршілікке қабілетті про- топластыларды бөлудің табыстылығына әсер етеді. Меристема- лық және каллустық протопластылар жеңіл, ал вакуольденген, дамыған хлоропластылы түрлері қиынырақ бірігеді. Протопластыларды іп у і і г о жағдайында нәтижелі өсіріп, олардан бүтін өсімдіктерді регенерациялауды 1971 ж. Такебе жүзеге асырды (14-сурет). Протопластылар өсіру үдерісінде жасуша қабырғаларын қалпына келтірген және өсімдік жасушаларының кәдімгі культурасы болып қалды. Бірнеше аптадан кейін каллустық жасушалар мен тіндер колониялары қалыптасады. Оларды өсімдік-регенерантын алу үшін агарланған қоректік ортаға қаита сеоеді. Темекі мен алқалардың басқа түрлерінің (петуния, картоп, томаттар) протопластыларынан өсімдік жеңіл алынады (15- сурет), ал дәндер мен бүршақтылардан - тамақтық өсімдік- тердің екі негізгі туыстықтарынан — бұны жасау әжептәуір күрдел і. Протопластылар биотехнологиялық нысанға жатады, өйт- кені оларды біріктіргенде мақсатқа сай белгілері бар өсімдік жасушаларының жаңа линияларын алады. Протопластыларды біріктіру арқылы өсімдік-регенеранттары биотикалық және абиотикалық күйзелістік факторларға төзімді гендерді тасы- малдауға болады. 73 9А00, ы ж жапырақ суспсніиялык культура каллус өеінді белш протошгастыларды зарарсыздау прото пластыларды есіру жуылған протопластылар нейлондық фильтр аркылы сүзу центрифупілау 100 г 3 мин осмотик 2 р кор. орта 1 р жасуша колониялары каші)с і оөлінүі регенерациясы морфогенез өсімдіктер- регенерантгары 14-сурет. Өсімдік жасушаларынан протопластыларды алу мен өсіру үлгісі (В.С. Шевелуха, 2003 ж.). 74 жапыракты зарарсыздау эпидермисгі алыптастау жапырақ кесіндісі ортада каллустер өсімдіктер түзейді шайқау төменп жылдамдықта центрифугалау мацерация мезофильдік плазмолизденген жасушалары целлюлазалар әсерімен жасуша қабьфғасын алыптастау, протопластылар прото- пластылар өлшемді көлемі агарлық орта каллустер колониялары 15-сурет. Картоп протопластьшарьш бөліп, өсіріп, өсімдіктерді регенерациялау (Г.Ж. Валиханова, 1996 ж.). Протопластыларды біріктірудің бірнеше әдістері қолда- нылады: - Бұған мүмкіндік беретін затгардьщ қатысуымен біріктіру (полиэтиленгликоль, поливинилдік спирт, кальций иондары); - Протопластылардың адгезиясы мен бірігуіне әкеліп соға- тын олардың суспензиясын электростимуляциялау жолы. Жапырықтар бөліктері 2 сағ. ------- ► байқап ферменттер маннит 75 Кейінгі 20 жылда биотехнологиялык нысандар рекомби- нанттық ДНК технологиясы негізінде алынған трансгендік өсімдіктермен толыга бастады. Әуелде агротехнология немесе өсімдіктердің дәстүрлі биотехнологиясы болды, одан кейін жасушалық биотехнология немесе жасушалық инженерия, өсімдіктер биотехнологиясы дамуының кейінгі кезеңі — гене- тикалық инженерия пайда болды (16-сурет). 16-сурет. Өсімдіктерді генетикалық жақсартудың биотехнологиялық эдістері (Г.Ж. Валиханова, 1996 ж.). Өсімдік шаруашылығында ДНК технологияларын қолда- нудың алғашқы нәтижелерін өткен ғасырдың 80 жылдары деп есептейді, сол кезде генетикалық түрленген өсімдік жасу- шалары, одан кейін каллустық тіндер және химерлік (гене- тикасы өзгерген) өсімдіктер альшды. Мысалы, химерлік өсім- дік санбин (бүл күнбағыс, оның геномына ақуыз — фазеолин синтезін кодтейтін бүршақтастардың гені кіріктірілген). Генетикалық материалды тасымалдаушылар - векторлар есебінде плазмидалар, хлоропластық және митохондриялық ДНК, транспозондар, вирустар қолданьшады. Ең жиі қолда- нылатынына агробактериялардың Ті-плазмидасы жатады, өйткені өсімдік жасушаларын жүқтыру - бүл аталмыш бакте- риялардың табиғи үдерісі, 9-кестеде өсімдік жасушаларынан бөтен ДНК-ны кіргізудің біраз әдістері келтірілген 76 9-кесте Өсімдіктер жасуш аларына ДНК енгізу әдістері і і | Әдіс 1 Түсінікгеме Ті-плазмиданы пайдалану Өте жақсы, жоғары нәтижелі жүйе, бірақ өсімдік- тердің барлық түрлері үшін қолдануға болмайды М икробөл шектермен атқылау (бомбылау) Өсімдіктер мен тіндердің көпшілігі үшін қолданы- лады; қарапайым және арзан әдіс Вйрустар негізінде векторларды қолдану Өсімдік жасушаларьша ДНК-ны кіргізудің нөтижесіз төсіш Өсімдік протопласты- ларьша гендерді тура енгізу Тек өсімдік жасушалары протопластыларына гендерді енгізу үшін пайдалануға болады, олардан тіршілікке қабілетгі өсімдіктер регенерациялануы мүмкін 1 Микроинъекциялар Қолдану аясы тар, өйткені инъекцияны бір рет тек бір жасушаға жасауға болады, мамандар ғана мани- пуляцияны жүргізе алады Электропорация Тек протопластыларға гендерді енгізу үшін қолда- нылады, олардан тіршілікке қабілетті өсімдіктікгер регенерациялануы мүмкін Липосомаларды бірікгіру Т ек протопластыларға гендерді енгізу үшін пайдаланылады, олардан тіршілікке қабілетті өсімдіктер регенерациялануы мүмкін Өсімдік жасушаларының вирустардың гендерін кіргізуге болады. Трансгендік ауыл- шараушылык өсімдіктері алынды, олардың геномына зиянды шыбьш-шіркейлер үшін уытты ақуыз синтезіне жауапты Васіі- Іиз іһигіп£ІетІ5 гендері енгізілген. Колорад қоңызына төзімді трансгендік өсімдіктер алын кең қолданылатын гербиңид — гликофосфатқа культурасы; провитамин А ((3 трансгендік әртүрлі боялған, әсіресе гүлдердің сәндік культуралары алынды; алынған трансгендік темекінің жапырақтарында бастапқы сурыптарымен салыстырғанда никотин мөлшері 77 әлдеқайда төмен. Өсімдіктердің 100-ден артык трансгендік сүрыптары коммерциялық пайдалануға рүқсат етшген, оның ішінде гербицидтерге төзімді 20-дан аса трансгендік өсім- діктер бар (10-11-кестелер). Бидайдың алғашкы трансгендік өсімдіктері 1987 ж. баллистикалық трансформация көмегімен алынды және сол кезден бастап дүниежүзінің көп зертхана- ларында бидайдың трансгендік өсімдіктерін алудың хаттама- ларын жетілдірудің зерттеулері жүргізілуде. Кейінгі жылдары терапевтік қолдану мақсатында адам ақуыздарын өндіретін, жейтін вакциналарды жасау мақса- тында микроорганизмдердің протективтік антигендерін өнді- ретін трансгендік өсімдіктерді алу технологиясы кең зертте- ліп жасалуда; вирустық ауруларға төзімді трансгендік өсім- діктер жасалуда (12, 13-кестелер). 10-кесте Г енетикалы қ трансформацияланған өсімдіктер Бакпажан Жер жаңғағы Сүлы Банан Канола Биік бетеге • Батат Орам жапырақ Қызыл бетеге Бүршақтар Картоп Қияр Жүзім Киви Орхидея Қалампыр Мүк жидегі Папайя Алмүрт Жүгері Петунья Жиматарғақ Латук Пион Арша канадал ық Лалагүлі Жолжелкен Европалық арша Лотос Күнбағыс Тары інжулік Жоңышқа Бидай Бүлдірген Сәбіз Күріш ' ® Қарабидай 78 11-кесте М икробелшектермен әртүрлі өсімдік жасушаларын атумен (бомбалаумен) алынған трансгендік өсімдіктер Терек Европалық және канадалық арша Ас бұршақ Қиярлар Мақта Жүзім Жер жаңғағы Темекі Өсімдік Жасушалар көзі Жүгері Үрықтық клеткалар суспензиясы, жетілмеген зиготалық ұрықтар Күріш Жетілмеген зиготалық үрықтар, үрықтық каллус Бидай Жасушалар суспензиясы, жетілмеген зиготалъпс ұрықтар Жетілмеген зиготалық үрықтар Шым түзеуші дәндер Қарабидай Үрықтық каллус Меристема Сорго Інжу тары Орхидеялық Банан Мүкжидегі Пион Жоңышқа Бұршақтар Жетілмеген зиготалық үрықтар Жетілмеген зиготалық үрықтар Протокормдар Үрықтык жасушалар суспензиясы Каллус Сомалық үрықтар Зиготалық үрықтар Үрықтық каллус Каллус Сабак бөлігінің іп шіго алынғандары Тозаңша Үрықтық каллус Зиготалық ұрықтар Зиготалық ұрықтар Үрықтық жасушалар суспензиясы Үрықтық каллус Тозаңша 8оиіһ§аІе еі аі., Віоіесһпоі., А сіу ., 13, 631-651, 1995. 79 12 к е с т е Вирус қабығының ақуызын синтездейтін вирустарға төзімді кейбір трансгендік өсімдіктер Өсімдік Вирустар-гендер көзі Иісоііапа Ьепіһатіапа, N. сіеуеіапсіі Алхордың жасырын мозаикасьшың вирусы Шсөйапа Ьепіһатіапа, асқабақ Қарбыз мозаикасының вирусы М соііапа Ъепіһатіапа, асқабақ Сары мозаикасының вирусы Папайя, темекі Папайяның сақиналы дақтықтың вир>сы Картоп Картоптың жапьфақ тарының бүралуының вирусы Картоп Картоптық У вирусы Картоп, ШсоШапа сіеЬпеуіІ Картоптық § вирусы Картоп, темекі Картоптық X вирусы Күріш Күріш жолақтығьшың вирусы Темекі Ақ шешек мозаикасының вирусы Темекі Соя мозаикасының вирусы Темекі Темекі оймалау вирусы Тбмекі Темекі жолақтығының вирусы Темекі Т оматтың қолатәрізді қоңьфлану вирусы Темекі, жоңышқа, томат Жоңышқа мозаикасының вирусы Т емекі, қияр Қияр мозаикасының вирусы Темекі, Шсоііапа Ьепіһатіапа Темекі погремкалығьгаың вирусы Т емекі, томат Темекі мозаикасының вирусы Томат Т омат мозаикасының вирусы Ғіісһш, Веасһу, Аипп. МісгоЪіоІ., 47, 739-763, 1993. 80 13 кесте Терапиялық қолдануға мүмкін адам ақуыздарын трансгендік өсімдіктермен өндіру мысалдары Өсімдік- қожайын Аурулар, синдромдар Ақуыздар Экспрессия деңгейі Жария ланған жылы Темекі Қаны аздық Эритропоэтин Арабидопсис (ақ шешенше) Энкефалиндер Есірткшермен улану Тұқым акуызының 0,10% Сарысу альбумині Темею Бауыр циррозы (шемен), күйіктер хирургиялық жарақаттар а 1 -р-глобин Түқым ақ)а>ізының 0,05% Т емекі < 0,01 % СРБ Түқым ақуызының 0,03% Протеин С Гирудин (тромбин ингибиторы) Т емекі Рапс Г иперкоагуляция Өсудщ эпидермалдық факторы а-интерферон Жараның баяу жазылуы Т емекі Мәлімет жоқ < 0,01 % СВ2 Күріш, шалқан Темекі А және В гепатиттер р-интерферон Г омоіримерлік коллаген Темекі Коллаген синтезшің бүзылуы Мәлімет жоқ Г ранулоцит- макрофаг- колониясын белсендіретін фактор Темекі Нейтропения 81 ________________________________ 1 ________________________________ 2 _______________________________ 3 ______________________________ 4 5 Өсу гормонының жетімсіздігі Темекі Соматотропин Мәлімет жоқ 2000 Көпіршікті фиброз, бауыр ауруы, қан кету Күріш а , -антитрипсин Мәлімет жоқ 2000 Трансплантат аластатылуының алдын алу Жүгері Апротинин (трипсин ингибиторы) < 0,10% СРБ 2000 Бактериалдық инфекциялар Картоп Лактоферрин 'СРБ - қосынды еріпш ақуыз. 2СВ - шикі. 3. Ж асуша культуралары және трансгендік жануарлар Мал шаруашылығы мен ветеринарияда биологиялық техно- логиялардың тиісті негізгі нысандарына ауыл шаруашылық жануарлары жатады. Табиги және қолдан сұрыптау, көп ғасырлы тарихы бар асыл тұқымды жануарлардың селек- циясы осы күнде де маңызды. Асыл түқымды жануарларды жақсартудың классикалық әдістеріне жатады: асыл тұқымды, ұрпақтық аталықтардың түқымдарын криоконсервациялау және аналықтарды қолдан үрықтандыру; эмбриондарды түр іші және түр аралық трансплантация технологиясы - химер- лік жануарлар (қойдан ешкіге, т.б.). Одан кейін жануарлардың өсірілген жасушалары мен тіндерін і п у і і г о жағдайындағы технологиясы арқасында жануарлар жасушасының культуралары биотехнологияның өз алдына нысаны болып шықты. Игл мен оның серіктері көрсеткендей, іп уііго жағдайында жануар жасушаларының тіршілік әрекетін қолдау үшін 13 аминқышқылдары қажет. Тірі бүтін организмге 8 ауыстырылмайтын аминқышқылдары (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин), ал жасушалардың бөлінген культуралары, олардың өсуі мен көбеюі үшін тағы 5 аминқышқылдары 82 (аргинин, глютамин, гистидиқ тирозин, цистин) керек. Қорек- тік орта құрамында витаминдер, әсіресе В топтары болуы тиіс: никотинамид, тиамин, пантотенат, пиридоксаль, рибо- флавин, фоли қышқылы, никотин қышқылы, холин, инозитол, биотин — олар жасушалар метаболизміне қатысушы фермент- тердің активті топтары есебінде. Жасушалар культурасын алғанда жануар тінін алдын ала протеолиздік ферменттердің (көбінесе трипсин) әлсіз кон- центрацияларымен оңдейді, олар десмосомалар - жасуша- аралық қосьшыстың ақуыздарын ыдырату мақсатында керек. Одан кейін жасушалар суспензияларын аминқышқылдарын, витаминдер, тұздар, көмірсулар, өсу факторын қамтып, жоға- рыда көрсетілген күрделі құрамды Игл, 199, т.б. қоректік ортаға салады. Жануарлар жасушалары мен тіндер культураларьга келесі мақсатта пайдаланады: - транспланталогияда қолданьшатьш биоматериал есебінде; - физиологиялық белсенді қосылыстар: интерферон, инсу- лин, өсу гормоны, интерлейкиндер, простагландиндер, лизо- цим, комплемент, т.б. биопродуценттері есебінде. Одан басқа рекомбинанттық ақуыздарды алады (14-кесте); - вакциналар, диагностикумдар және басқа вирустық пре- параттарды алуда вирустарды өсіру үшін; - гибридтік жасушаларды, оның моноклональдық анти- денелерінің продуценттері - гибридомаларды алу. Рекомбинанттық ақуыздардың продуценті есебінде жа- нуар жасушаларын пайдаланудың артықшылығы сол, эука- риоттык жасушада синтезделетін ақуыздардың посггрансля- циялық түрленуі (гликозилдену, т.б.) және олардың биология- лық белсенді күйде экспрессиясы жүзеге асады, бүл бакте- риалдық, прокариоттық синтездік жүйелерде мүмкін емес. Сонымен бірге жануарлар жасушаларының тіршілік қабі- летін қолдау технологиясы і п у і і г о жағдайында бактериалдық культураларға қарағанда әжептәуір қиын. Қоректік орталар құрамының күрделілігімен қатар жануар жасушаларының өздері і п у і і г о жағдайында өсіргенде механикалық зақым- 83 14-кесте Биологиялық белсенді заттардың продуценттері-рекомбинантты қ жануар жасуш алары культураларыны ң сипаттамасы (Н.В. Томилин, 1987 ж.) Өнім Реципиенттік жасушалар Вектор көзі Вектор типі Өнім шығымы 1 2 3 4 5 Р-интерферон Қытай атжал- маныньщ аналық без жасушалары Вирус 5У-40 Амплифика- цияланған (2:3)х105 бірлік/мл тәул. ү-интерферон 1Г IV II 106 8ір./мл тәул. Фибробластар " II . .; 4 Автономды (3:4)х105 бірлік/мл тәул. Адамның өсу гормоны Аналық без жасушалары Интегратив- тік 50 мкг/мл тәулік Адам В-гепатиті вирусы қабығының ақуызы 1 * 1! ^ ‘ Гепатит вирусы Амплифика- цияланған 2,5х 106 мг/кл тәул. II . Тышқан фибробласт- тары Металтионин гені Автономды 10 мкг/мл тәулік Адамның өсу гормоны II II II 10"5 мкг/кл тәул. Плазминоген- нің тіндік белсендіргіші Қытай атжал- манының аналық без жасушалары Аденовирус Амплифика- цияланған Жаңа синтез- делетін ақуыздың 5%-на дейін С-тус онкогеннің ақуызы Ген һзр 70 II Жалпы ақуыз- дардың бірнеше пайы- зына дейін 84 1 2 3 4 5 Бүканың лютеиндейтін гормоны 19 Вирус 8Ү-40 і •!! • дануға оңаи ұшырайды. Жасушалардың өлуі, культурада жасуша қалдықтарының болуы, олардың жоғары өнімділігіне қол жетуге бөгет жасайды, биотехнологиялық үдерісті бұзады. Өз алдына биологиялық нысанға жалпы ңитоплазмамен және біріккен ядромен екі жасушаның бірігуі жолымен алын- ған гибридомалық жасушалар жатады. Жасушалардың бірігуі организмнің онтогенездік дамуында болады, аналық және аталық жыныстық жасушалардың (ооңиттер мен сперматозоид- тардың) үрықтануында олардың мембраналарының бірігуі нәтижесінде іске асады. Бластоңиста жасушаларының жатыр қабырғасы жасушаларымен бірігуі үрықтың имплантаңия- сын, бұлшық ет тінінің негізін құрайтын көп ядролық бүлшық ет түтікшелерінің қалыптасуын қамтамасыз етеді, бұл да бір ядролық бұлшық ет жасушаларының бірігуімен байланысты. Көп инфекциялық ауруларды қоздырушылардың (вирустар, бактериялар, хламидиялар) мембраналарының макроорга- низм жасушаларымен байланысуы патологиялық үдерістер- дің дамуына әкеліп соғады. Жануарлардың тым әртүрлі жасу- шаларын біріктіреді: эмбрионалдық және жетілген қалыпты және қатерлі жасушаларды, бөлінуге қабілетті және қабі- летсізді, т.б. Сомалық жасушалардың гибридтерін, гендердің фенотиптік көріністерін зерттеуде, геномды картирлегенде, жасуша жетілдіру механизмдері мен жасушалық атипизмнің пайда болуын түсіну үшін пайдаланады. Гибридтік жасуша- ларды қолданудың жеке бағыты моноклональды антидене- лерді, гибридома-моноклондар продуңентін алу технологиясы болды. Екі жасушаларды табысты біріктіру үшін Сендай виру- сын, полиэтиленгликоль, электрлік потенциалды қолданады. Биотехнология нысаны есебінде биологиялық агент түрін- де жануар жасушалары ішінде эмбрионалдық үрпақтық жасу- шалар (Э¥Ж) бөлінеді. ЭҮЖ 3 типін айырады: сүт қоректі- 85 лердің имплантация алдындағы ұрықтарының эмбриобласт- тары. Соларды ғана Э¥Ж деп атауға келіскен: - эмбрионалдық карциноманың жасушалары, — ұрықтардың премордиалық жыныстық жасушалары (¥ПЖЖ). Эмбрионалдық ұрпақтық жасушалар тотипотентті, яғни дифференцацияға шексіз потенциалды және ядролық жасу- шалардың генетикалық ақпаратын жұзеге асыруға қабілетп, олардың жетілдірілуі және де бүтін организмге дамуын қам- тамасыз етеді. Эмбриондардың ретровирустық трансфек- циясы жолымен эмбрионалдық жасушага экзогендік ДНК экспрессиясы жөнінде, пронуклеуске ДНК-ні микроинъек- циялау, вектор есебінде трансгендік сперманы пайдалануды зерттеулер қарқынды жүруде. Трансгендік ж ануарлар Трансгендік технологияның негізгі нысанасы зертханальщ ақ тышқандар болады. Атап айтқанда олардың жасушала- рына, организміне жаңа ақуыздардың дәрілік заттар синте- зіне жауапты бөтен гендер кіргізілді. Сонымен бірге адамнын тұқым қуалайтын патологиясын моделдеу үшін де әртүрлі ауруларға үшырататын гендерді оларға енгізді. Трансгеноз жолымен "жаңа қызметті" тудырып, немесе керісінш е, "қызметті жоғалтуға" болады. "Қызметті жоғалту" мысалы ретінде тор көз таяқшалары- ның инактивациясына әкеп соғатын тышқандар родопсин генінің бағытгы инактивациясын ("нокаут") келтіруге болады, бүл пигменттік ретинит секілді адам ауруын имитациялайды. Өсу гормонының гені бар алғашқы трансгендік тышқандар 1982 жылы өсірілді. Кәдімгі тышқандарға қарағанда оларда өсу жьшдамдығы 4 есе жоғары болды, ересектерінің салмағы қалыптыдан 2 есе артық. Бірақ өкінішке орай, ауыл шаруа- шылық малдарында (қой, шошқа, сиыр) олардың геномына өсу гормонының генін кіріктіргенде осындай нәтижелерге қол жеткізген жоқ. 1980 жылы үрықтанған жүмыртқаларға гендерді кіргізу жолымен алғашқы трансгендік жануарлар 86 жасалынды. Дүниежүинің басгы бнотехиолоіиалмк орги лықтарында 20-лан аса түрлі грансгендік жануарллр алынды сиыр, қой, ешкі, кояндар. т.б. Олар плаімииогеинін белсен- діргіштері, моноклональлы антидене. >ритропоиин. интер- лейкин, антитрипсин, т.б секілді биолоі иялык белсенлі косы- лыстар өндіреді. Аталмыш қосылыстар көбінесе сүтпен внеді "Биореактор" есебінде сүт беііи пайлаланулын дүрыстыгы сод ауылшаруашылык жануарларынла сүт жеткілікті мол- шерде сауылады және жана акуыілын косымпіа секрениясы оның қьпметтік күйіне жағымсьп асер етпейді. V. Ш УІТКО ЖАҒДАЙЫНДА ЖАСУШ АЛАР МЕН ТІНДЕРДІ САҚТАУ Тірі организмдердің, жануарлар мен құстардың сирек тұқымдары, өсімдіктер линиялары мен сұрыптары, өнер- кәсіптік бағалы микроорганизмдер болсық табиғаттың бөлін- бейтін бөлігі есебінде, генофондты сақтау әрқашан тұтастай биологиялық ғылымның маңызды міндеті боі бермек. Қайта қалпына келетін генетикалық материал есе- бінде тірі жасушалар әр уақытга қажет болады, әсіресе жаңа іргелі білімдер, жаңа технологиялар пайда болғанда. Биотехнологияда биологиялық ресурстарды сақтау мен көбейтуде өндірістің әртұрлі салаларында қажет болатын продуценттік заттардың жаңа биологиялық нысандарын жасау өте маңызды. Биологиялық нысанның жұмыстық қалпын сақтап тұру, оның өндіргіш белсенділігін қолдап тұру - бұл биотехнологиялық өндірістің негізі, табыстың кепілі. Селекңия немесе генді-инженериялық технология жолы- мен жасалған өнеркәсіптік микроорганизмдер тағы штамдар- мен салыстырғанда тұрақсыздау, төзімсіздеу, паидалы қасиет- тері реверсияға, жоғалуға немесе әлсіреуге оңаи ұшыраиды; штамдар - аса жоғары продуңенттер көбінесе ауксотрофты. Сондықтан өндірістік микроорганизмдерді сақтайды, олар- дың коллекңиялардағы тіршіліктік қабілеті мен өндіргіштік қасиеттерін қолдайды. Коллекцияның міндеті - микроорга- низмдердің тіршілік қабілетін қолдау және басқа микрофло- рамен ластанудың алдын алу үшін керекті барлық сақтық шараларын іске асырып сақтау; белгілі уақытқа дейін сақтау (патенттік процедура үшін микроорганизмдерді жинауды халықаралық келісім жөніндегі Будапешттік келісім бойынша 30 жылға дейін; Будапешт, 28 сәуір 1977 ж.). Коллекция - бүл арнайы ғылыми бөлім, онда тек генетикалық ресурстар сақталып қана қоймайды, бағалы культуралардың фено- және генотиптік сипаттарын зерттеуді қамтамасыз етеді. Коллек- цияларда әртүрлі микроорганизмдер-продуценттерді скри- нингтеу, сақтау әдістерін жақсарту, қоректік орталарды жетіл- діру, криопротекторларды таңдау үшін барлық жағдайлары 88 бар. Бірталай елдердің коллекциялары генофондты сақтау жөне тиімді пайдалану бойынша, ғылыми-тәжірибелік міндеттерді бірігіп орындау, ынтымақтастық үшін қүрылған ресми жөне ресми емес үйымдарға енеді. Биотехнология мо- лекулярлы-генетикалық зерттеулерге, ДНК-технологияларға сүйенетінін ескерсек, гендер банкісінің ролі, генетикалық ақпаратының өзін тасымалдаушы ДНК-ні консервациялау маңызы артады. Мәдени өсімдіктер генофондының коллекциялары өсімдік ресурстарын (түқымдар, егетін материал, т.б.) жинау мен жан- жақты зерпггеумен шүғылдануы тиіс. Өткен ғасырдьщ 1980-жыл- дары тек өсімдік шаруашылығының Бүкілодақтың ҒЗИ кол- лекциясында алғашқы материалдық 300 мыңнан аса үлгісі болатын: олар мәдени өсімдіктер түрлері мен тағы түқымдас- тары (15-кесте). 15-кесте Н.И. Вавилов атындағы өсімдік ш аруаш ылыгы Бүкілодакты ң ғылыми-зерттеу институтынын дүниежүзілік коллекциясы ны н күрамы (Муромцев Г.С. т.б., 1990 ж.) Тірі организмдер саны Дақылдар 1 қаңтарға 1980 ж. 1960 ж. 1970 ж. 1 желтоқсанына Дәнділер 102 990 (жүгері мен жармалық дақылды- ларсыз) ! 34755 41311 45 942 Жүгері мен жармалық дақылдар 27 365 34021 : 33 860 Дәнді бүршақтар 17 003 22531 20 559 Техникалық және майлы 13 979 15966 10 422 Т үйнекті үрықтылар 2 822 5417 17173 Т амьфлы үрықтылар Жемдік 12 976 10 970 37 040 Бақшалы және көкөністік 16 631 17 563 Жемістік, жиделік, субтропикалық, сәндік, жүзім 18 234 32 903 31 282 Барлығы 143 765 180 682 299 268 89 Өсімдіктер мен жануар жасушаларын іп у і і г о жағдаиында ұзақ күтім, сақтау олардың бастапқы белгілерінің сақталуына әсер етеді. Өсімдік жасушаларының популяңиясында хромо- сомалардың кейін қайта қүрылуымен, олардың саны өзгеруі- мен (жасушалармен ядроның бөлінбеуіне қарамастан хромо- сомалардың еселенуі) митоздық циклдің бүзылулары болуы мүмкін. Хромосомалардың іп ш іго жағдайында сандарының бұзылуы көбінесе каллустық жасушалар популяциясында байқалады, ал ұзақ пассажда бүл генетикалық өзгерістер жинала береді, бүл ақыр алғанда бастапқы пайдалы касиетінің жоғалуымен, озгеруімен қауіпті. Сұрып, линияны і п у і і г о жағдайында сақтау және бастапқы белгілері бар гибридиза- ция жүргізу үшін керекті тозаң; өте сирек және жекелеген түқымдар; өсімдік жасушаларының трансформацияланған гибридтері; зиготалық және сомалық үрықтар генотипі селекционерді қай уақытта болсын қамтамасыз ету үшін жасушалар мен тіндерді сақтаудың арнайы әдістері болады. Соған үқсас жағдайлар жануарлардың эмбриондық жасуша- лары мен тіндерін сақтағанда да туындайды. Ол түгіл тіндік жасушаларды өсіру құрамы жағынан өте күрделі қоректік заттарды керек етеді (16. 17-кестелер). Өсірілетін жануар жасу- шаларын микоплазмалар, вирустармен ластануы (контамина- ция) қаупі бар. Жасушалар мен тіндер культураларының тіршілік қабіле- тін сақтау және қолдау үшін әуелден негізін қайталап себу әдісі болды. Мысалы, аспоралық бактериялар жаңа қоректік ортаға айына 1-2 рет, споралық бактериялар, актиномицет- тер, ашытқы жасушалар мен мицелиалдық өңездер 2-3 айда 1 рет қайталап себіледі. Мүндайда қайталап себу үшін куль- тураларды өсудің стационарлық фазасында пайдаланады, сонда олар іп у і і г о жағдайьшда сақтау жағдайын жақсы көте- реді. Сонымен бірге қатты ортаға қайта себуге, қараңғыда, 5-20°С-та, вазелин майы астында (0,5-1,0 см қабат) сақтауға тырысады. 90 16-кесте Негізгі синтездік қоректік орталардың жазбашасы Хенкса ерітіндісінде Иглдің негізгі ортасы (ВМЕ) (модерниза- цияланған) Эрл немесе Хенкс ерітін- дісінде Игл ортасы (МЕМ) (минимал- данған) даенттер мг/л ерітіндісінде Иглдің негізгі ортасы (ВМЕ) (модерниза- цияланған) Аминқы шқылдары: 1-аргининНСІ 1-цистин 1 -цистин 2НгО 1 -глютамин 1 -гистидин НСШ20 1 -изолейцин 1-лейцин 1 -лизин СШ 1 -метионин 1-фенилаланин 1-треонин 1-триптофан 1 -тирозин 1-валин Витаминдер: биотин Г>-Са пантотенат I холин хлорид фоли қышқылы і-инозитол никотинамид пуридоксаль НСІ рибофл авин тиамин НСІ Бейорганикалық туздар Эрл ерітіндісі СаСІ2 х 2НСІ КСІ МеСО. х 7 Қ О ИаСІ №НСО 91 1 2 3 4 Ы аҚРО. х Н ,0 Хенкс ерітіндісі 140.0 185.5 185.5 СаСІ, х Н ,0 • 400.0 400.0 КСІ £ М 1 ' 60.0 60.0 КН2Р 0 4 - 200.0 200.0 м§ео4 х 7 н 2 о | | ■ і і*г 9Ц| щЩ 8000.0 8000.0 ЫаСІ $ ~ ' ; і* ■ $'Т ' - % - !' §1 Щі 1 Г ;' ■ *1 - ( 60.0 ^ аН 2Р 0 4 х 2Н20 47.50 350.0 ЫаНСО, 11 •- Шшчщы і 1100.0 Э(+)глюкоза х Н20 1000 1000 0 - глюкоза 17.0 17.0 10.6 фенолдық қызыл 17.0 17.0 1 - ] сукцин қышқылы 84.0 70.0 211.0 Аминқы илқылдары: 1 -аргинин НСІ «• .. 1 -аргинин 62.57 26.069 - I 1 -цистин 2НСІ 0.11 V ;; '' “ "5"' 1 -цистеин НСІ х » - І 'щ' ' ’ ; 31.5 Н 20 584.0 100.0 146.2 т т 1 -цистеин 2НСІ 30.0 50.0 7.51 ■ 1 -глютамин 42.0 21.88 21.06. глицин 104.8 20.0 06 2.6 1 -гистидин Н СІН 0 104.8 60.0 13.1 А Н І 1 -изолейцин 146.2 70.0 29.3 1-лейцин о • о 15.0 4.48 1-лизин НСІ 66.0 25.0 4.95 1 -метионин 42.2 25.0 10.50 1 -фенилаланин 95.2 30.0 3.57 1-серин 16.0 10.0 0.60 1 -треонин 72.0 40.0 1.81 1 -триптофан 93.6 25.0 3.5 1 -тирозин 25.0 8.91 1-валин - ' * ■ - : 30.0 13.3 1-аланин 66.82 14.7 аспарагин қышқылы І : 10.0 і£ Ш глютамин қышқылы - 40.0 11.50 1 -гидроксипролин 1 - 1 - 15.0 1-пролин -* ч - ^ ,к ~ ^ .. 1 -аспарагин 1 -аспарагин Н20 глютацин Витаминдер: 4.0 0.01 0.024 Э-биотин 4.0 0.01 0.715 92 4 Са- □(+ )пантотенат 4.0 1 0.05 I 0.698 холин хлорид 7.0 0.01 1.32 фоли қышқылы 4.0 0.05 0.541 мезо-инозит 4.0 0.025 0.615 никотин қышқылы 0.025 1 - пиродоксаль НСІ 0.4 0.376 пиродоксин НСІ і 40 0.01 0.376 рибофлавин • 11 0.01 1.012 тиамин НСІ • К '/ 3$ 1 ; - 1і 0.5 1 -аскорбин қы шқылы 0.1 1 - '/Щ кальциферол (вит.Д) ~ у А?Лиж?Іі 0.05 ] • дйһ глютатион | - ч І=И 0.05 К * менадион-Ыа-бисульфит I . "г 0.05 ■ - - Р-аминобензоат. қ-лы - " | і 1 1.1147 вит. А [ - ■ | 0.01 ОЬ-а-токоферолфосфат 1 * , 1.36 вит. В 1100.0 1100.0 1210.0 0(+)глкжоза Н20 110.0 1. 8 110.0 Ыа-пируват 10.0 1 - аденинсульфат / 7-кесте Ең кең қолданылатын қоректік орталар Қоректік орта 199 орта Иглдің негізгі ортасы, ВМЕ Диплоидтық жасушаларды күту үшін Иглдің негізгі ортасы, ВМЕ 1151 ІЛ О И Д Қүрамының ерекшеліктері және қолданылуы Кең қолданылатын көп қүрамды орта, полиовирусты өндіру үшін соны тағайындалған және пайдаланылған вирустық инфекциялардың диагностикасында қолдануға үсынылады Аминқышқылдары мен витаминдердің төмен жиынты ғында кәдімгі пайдаланылатын орта НеЬа, КВ т.б. жас> шаларды өсіруге соны тағайындаған ВМЕ М §§04 салыстарғанда М§СІ2-ге, ауыстырылған, і-инозитол алынып тасталған 93 1 2 Иглдің минималды ортасы, МЕМ ВМЕ-ге қарағанда аргинин мөлшері 2 есе, гистидиндікі 4 есе арттылган, глютаминнен басқа аминқышқылдары екі еселік жиынтықта, биотин аггынып тасталған. Қоректік орта қүрамына жоғары талапты жасушалардың енгізілетін линияларының көбісін өсіру үшін қолданьшады, куль- тураларды қорек қоспай үзақ уақыт қолдануға мүмкіндік береді. Өсімдік тіндерін меристемалар культурасы әдісімен сауық- тырған пробиркалық өсімдіктердің кезеңді субклондауы жолымен өсіп келе жатқан коллекциясы түрінде қолдайды. Қайта себусіз (субклондау) кезекті, 1-10°С мен 4000-5000 люкс жарық қарқынында сақтай түрып, 6-24 айға дейін үзартуға болады. Бірақ организмдерді сақтаудың дәстүрлі әдістері (микро- организмдерді қайта себу мен пробиркалық өсімдіктерді субклондау) белгілі кемшіліктерге ие. 0-4°С температурада жасушалар болінуінің жалғасуы мүмкін, жиі қайта себулер қайтседе керексіз, орынсыз мутацияларға әкеп соғады, бөтен микрофлорамен контаминация қаупі бар, культура өнімділігі- нің төмендеуі мүмкін (әрбір қайта себуден кейін штамның қызметтік белсенділігіне скрининг жүргізу қажет). Анабиоз жағдайында, алмасу үдерістерінің толық тоқта- луында микроорганизмдер, жануарлар мен өсімдіктердің бөлін- ген жасушалары мен тіндері болу мүмкін. Анабиоздық күй негізі - жасушалардың сусыздануы (қүрғалуы). Сондықтан бағалы қасиеттерін жоғалтпай жасушаларды үзақ сақтау үшін оларда жүретін метаболиттік үдерістерді, оның ішінде гене- тикалық қайта қүрылуды күрт баяулатуға мүмкіндік жасай- тын әдістер ең оңтайлы - бүл лиофилизация мен криоконсер- вация. Л иофилизация (лиофилдеу) - бүл вакуумдық жағдайда алдын ала мүздатылған жасушаларды қүргату, онда жасуша ішіндегі су, төмен температура кезінде сүйықтық фазаны айналып өтіп, қатты күйден газдық түрге ауысады. Лиофилдік қүрғату бактерияларды, актиномицеттерді, микоплазмалар- 94 ды, мицелиалдық өңездерді, ашытқы жасушаларын, балдыр- ларды, қарапайымдылар, вирустар, вакциналар, қан плазма- сын сақтағанда пайдаланады. Лиофилизацияда тірі жасуша- лар мұздатылуға, құрғатылу және регидратацияға ұшыраты- лады, одан кейін олар вакуумдық жағдайда немесе инерттік газ қатысуымен 4-6°С, қараңғыда, түмшаланған буылтықта немесе флакондарда сақталады; лиофилденген жасушалар- дың қалдық ылғалдығы 2-6%-ға тең. Буылтықта немесе фла- кондарда культуралар - 40-60°С-қа дейін мүздатылуын, одан кейін төмен атмосфералық қысымда, вакуум жағдайында қүрғауға үшырайтынын, жасуша іші мен сыртқы судың мүз- далып, буланатынын атап өту керек. Мүндай әдіс мүз крис- талдарының механикалық зақымдануынан жасуша іші мен жасуша сырты ортасының осмостық градиентінің қатты айырмасынан жасушалық және жасуша іші мембраналарын ең нәтижелі қорғауға мүмкіндік береді. Лиофилдеу кезінде су шыққанда зақымданулардан жасу- шаларды қорғау үшін, мембрандық қүрылымдарды түрақтан- дыру үшін қорғаныс орталарын - сарысу, сахароза, желатин ерітінділерін, майсыз сүтгі пайдаланады. Лиофилдеуге микро- организмдер культураларын осудің экспоненциалдық фаза- сының аяғында алады. Лиофилизацияның технологиялық тәртібі әртүрлі нысандар үшін әртүрлі, оңтайлы жағдайлар микроорганизмдердін жануарлар мен өсімдіктер жасушалары мен тіндерінің әрбір тобы үшін бағдарланады. Криоконсервация (кгуез - аяз, муз) - бүл тіршілік қабілет күйіндегі биологиялық нысандарды, оларды терең мүздату- дан кейін, сүйық азотта (-196°С) немесе оньщ буында (-150°С) үзақ ұстау жолымен сақтау. Криоконсервілеу, анабиоз күиін іске асыра, жасушалар популяциясының гендік фонының бүлінуінің толық алдын алады. Осы әдіспен цианобакте- риялар, шымқай қызыл және жасыл балдырлар, мицелиалдық өңездер, актиномицеттер, өсімдік және жануарлар жасуша- лары, гибридомалар, генетикалық түрленген жасушалар сақ- талады. 95 Криобанктарды жасау жануарлар мен өсімдіктердің сирек және құрып бара жатқан түрлерінің генофондын сақтау оңтайлы тәсілдерінің біреуі десе болады. Осы күні жасуша- лардың, тіндер мен ағзалардың терең мұздатылуы, медици- нада және мал шаруашылығында кең таралды. Өсімдіктерде басқаша. Өсімдік жасушаларының көлемі үлкен, олардың вакуольдары ірі және суы көп, сондықтан мүздату мен кейін ерітуде қаттырақ зақымданады. Осыған байланысты үсақ меристемалық жасушаларды, құрғатылған тозаңшаны крио- консервілеу жеңілірек. Криоконсервілеу үдерісі келесі кезеңдерді қамтида: жасу- шалар культурасын дайындау, криопротекторды кіргізу, сұйық азотта бағдарламалы мұздату және сақтау, жылдам еріту, криопротекторды алып тастау, микроорганизмдерді қайта өсіру немесе өсімдіктерді регенерациялау (17-сурет). Культураны дайындау кезеңі — бүл әртүрлі осмостық белсенді заттар (маннит немесе сорбит, 2-6%), аминқышқыл- дары (көбінесе пролин, ол жасушаларда суда жақсы ұстай- ды) бар қоректік ортада өсіру. Криопротекторлар - бүл мүз- дату нүктесін төмендететін заттар, жасуша ішіндегі суды ұстайды және жасушиларды механикалық және осмостық күйзелістен қоргайды. Оларға жатады: диметилсульфоксид (ДМСО) 5-10%, глицерин 10-20%, поливинилпирролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (молекулалық массасы 6000). Сонымен микробтық өсімдік жөне жануар жасушаларын ұзақ сактау үшін ең тиімді және кең колданылатын лиофилдік қүрғату мен криоконсервілеу; қайта себу биоматериалды қысқа уақытқа сақтағанда, жүмыстық коллекциялар үшін жиі пайдаланылады (18-кесте). 96 Культураны дайындау Культураны концентрациялау Криопротекторды енгізу Буылтықтарға ауыстыру Бағдарламапы мұздату I____ I г Сүйық азотқа салу Клеткалар кулътурасы Еріту Өсіруді орнына келтіру Ш М V Криопротекторды алып тастау 17-сурет. Ж асуш алар культурасы н криосақтау кезеңдері (Г.Ж . В алиханова, 1996 ж .) 97 * і 0 0 5 Ь м һ а еп > * X м м п 03 Н * < я • тт ои 2 м 5 X Л (■ 4 О . о о а . в 5 а і о 35 а > £ Я 6 а а > Н у _ ^ Ф * Ч а >* н а Ф I 1 Е І і ? I? 11 I 9 & 0и т С | I | Е * ■ I Е <* д ІЁ 5 01 $ £ с» І ^ . а СЗI ? & ■ « «0 ** 'с 5 1 5 | 2 з I 1 % 8 * 6 * 5 §*1 1 § Ц С І 5 & | а іс 3 3 ' о ' I І' 41 8 I* & *$ 2 3? м ІІ з 1 Ш &і II о о о о о о о о о о о о о о о о о о р о о о о о ^ "1 ш* о о 00 00 — X * * о о о о г п г о сЛ о о о о о о о о о о гл«— сп (Л ^ II о о ц і о 3 2 К * *п %г» А А К * 'Г г п |ч | т т г і п * * X * 5 Ч 3 к * г * 7 " " "ОО С Ч ^ ч Г - Ч - Г Ч Г Ч І Г » — м 'в' » X «7 I *Т — 1 X * * Г 4 г*і 5 с 2 з X X «/■> ІГ> * 1 м м Г4 1 * м * * — гм * м К <Т * п м * X п т , I • м м ?х а — >о і т 'О ГЛ X сч X » гч — * т мі X X — гч I 1 ь Г>4 С * я - т г т г — я Ю і § І X О 3 * о X о . • к * К *? — — ГІ => 5 Я 3 « X о о 5 5 з з X к о о см м • I о о 3 * * «2 еЭ — X м »Л Г4 Г ' I I I I I X — тг <Л ^ >х я см - М N 00 * I х * «л * 1 ІГ» I * N 0 І П «Гі ю * 3 *г> I ТГ Ч 5 2 X X N <0 5 | I з * * Й * ? « ■— >о 5 § § і X X/ х X чэі *о 4|1 п ' • •5Г л N >Х ев *§! ж еа ё 2 м I п 32 в зХ Я с; >> ф * Т Т * о — о — — <м — — ЗХ я 522 еа зД ев 5Х еЭ X 3 зК ■ о СБ т 15 с ^ м ор ОІ ■ ■ » * --. 9 9 9 — — — — — гч <- — — — «5 «Б я св >С >С т т зх зБ ео св І Л V"» • > а я І ь х а §5 а> -С 2 3 £ ь § 5 § 3 . 8 “ Ч> 5 ■8 5 «е | з 5 о і 1 2 I т- 3 о -с 0 1 -5 о 5 л V. Й о -§ о § 53 б о 5 о х; сз •с Е . л жүктеу/скачать 11,01 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|