В данном обзоре рассмотрены основные методы создания гетерологических биохимических путей в различных организмах, основные проблемы, воз- никающие при этом, и основные подходы к их ре- шению
GC-содержание и проблемы с предпочтением
жүктеу/скачать 0,69 Mb. Pdf көрінісі
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Оптимизация комбинации ферментов пути
| GC-содержание и проблемы с предпочтением
кодонов Как упомянуто выше, определенная кодирующая по- следовательность ДНК может быть получена либо непосредственно из исходного генома, либо синте- зирована химически. В последнее время легкодо- ступными и приемлемыми по цене стали технологии точного крупномасштабного синтеза ДНК (например, [75, 76]). Дополнительным преимуществом химиче- ского синтеза является возможность модификации кодонов в кодирующих последовательностях гете- рологического пути в соответствии с параметрами организма-хозяина [2]. Показано, что улучшение состава кодонов, приводящее к увеличению экс- прессии гетерологических генов [77–79], может быть проведено либо вручную с помощью баз данных [80], либо с помощью бесплатных биоинформатических инструментов оптимизации кодонов [75, 81]. В свою очередь, оптимизация кодонов приводит к оптими- зации содержания GC-пар в соответствии с предпо- чтениями хозяина, что обеспечивает более легкую репликацию гетерологической ДНК в организме-хо- зяине и таким образом снижает нагрузку от гетеро- логического пути. Оптимизация комбинации ферментов пути Эффективность гетерологического пути не зави- сит линейно от количества копий генов, входящих в него. Продукция метаболитов биосинтетического пути с увеличением дозы генов сначала возрастает, однако затем избыточная экспрессия гетерологиче- ских белков приводит к значительному снижению выхода целевого соединения, поскольку внутрикле- точное накопление метаболитов может приводить к запуску стресс-реакций, и клетки-хозяева не мо- гут обеспечить необходимую скорость переработки накапливающихся метаболитов [25]. Поэтому добав- ление дополнительных копий генов полезно только в случае генов ферментов лимитирующих стадий, но изменения количества копий других генов пути на выход конечного продукта практически не вли- яют [82]. Например, показано, что дозирование ге- нов эффективно при биосинтезе гетерологических β-каротиноидов в Yarrowia lipolytica [83]. Наиболее эффективный гетерологический путь может сочетать ферменты различного происхожде- ния, гены которых происходят из нескольких мета- 36 | ACTA NATURAE | ТОМ 12 № 2 (45) 2020 ОБЗОРЫ болических путей или даже нескольких различных организмов [77]. В некоторых случаях достаточно комбинации ферментов, относящихся к родствен- ным путям биосинтеза из разных источников [42, 84], тогда как в других требуется добавление вспомога- тельных генов, кодирующих белки-активаторы, на- пример фосфопантетинтрансферазу [85]. Пространственная близость активных центров ферментов способна повышать суммарную скорость конверсии гетерологического метаболита и снижать уровень накопления промежуточных соединений. Достигнуть такого сближения можно путем прямого слияния белков между собой или формирования бел- ковых каркасов. Преимущество формирования бел- ковых каркасов по сравнению с непосредственным слиянием заключается в сохранении аминокислотной последовательности фермента, что, как правило, по- лезно для его функционирования. Используют три основных типа каркасов: ДНК-каркас, основанный на плазмидах и позволяющий легко изменять рас- стояние между взаимодействующими белками, РНК- каркас, преимущество которого заключается в не- большом размере, и различные варианты белковых каркасов [55]. Внутриклеточная компартментализация фер- ментов гетерологического пути накладывает огра- ничения на продукцию метаболитов. К счастью, для митохондрий, эндоплазматического ретикулума, вакуолей, ядер, мембран и пероксисом эта проблема может быть решена путем совместной локализации всех ферментов в одном и том же компартменте с ис- пользованием хорошо известных сигналов локали- зации. Ассоциированные с мембраной ферменты предъ- являют самые строгие требования к внутрикле- точной локализации, поэтому часто требуется со- вместная локализация всех остальных ферментов метаболического пути в той же мембране [86]. Ранее были разработаны несколько коммерчески доступ- ных наборов инструментов для правильного разме- щения ферментов пути в специфических компар- тментах дрожжей [86] и хлоропластов растений [42]. Конечной целью гетерологической экспрессии метаболических путей является продукция ценных вторичных метаболитов при помощи цепочки фер- ментативных реакций, где размеры отдельных ре- комбинантных белков не влияют на выход целевого продукта. Размер любого рекомбинантного белка ха- рактеризуется длиной кодирующей его генетической последовательности, а также диктуется простран- ственными ограничениями, налагаемыми клеточной и субклеточной компартментализацией гетерологи- ческих путей в клетках-хозяевах. Таким образом, максимизация продукции гетерологических метабо- литов представляет собой многоплановую проблему оптимизации, в которой вклад эффективности белков гетерологического пути преобладает над их количе- ствами и размерами. жүктеу/скачать 0,69 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|