Гылыми журналы многопрофильный научный журнал

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
 
7 
Замуриева Анна Валерьевна  –
 
магистрант кафедры «Ветеринарная санитария»  Костанай
-
ский государственный университет имени А.Байтурсынова, тел: 8
 7772960802, e-mail: anna_zamu-
rieva@mail.ru 
адрес: 110000, Костанай, ул. Садовая
 100
а
 
кв
 5;  
 
Batyrbekov 
А
sylbek Nurlybekovich - Senior Lecturer, Candidate of Veterinary Sciences, Department of 
Veterinary  Sanitary,  Baytursinov  Kostanay  State  University,  Phone:  8-7141-53-78-
76,  е
-mail:  Asyl-
bek555@mail.ru, address: 110000, Kostanay, Mayakovskii street 99/1.  
Tagayev Orynbai Orazbekovich  - Doctor of Veterinary Science, the professor of the  Veterinary Sani-
tary,  Baytursinov  Kostanay  State  University,  Phone:  8-7142-51-11-73,  e-mail:  orynbay_tagayev@mail.ru, 
address: 110000, Kostanay, Baytursynov street 47.  
Zamurieva  Anna  Valerievna 
–
  master  student  of  the  Department  of  Veterinary  Sanitary,  Baytursinov 
Kostanay  State  University,  Phone:  87772960802,  e-mail:  anna_zamurieva@mail.ru    address:  110000, 
Kostanay, Sadovaya st. 100a, 5;  
 
Батырбеков  Асылбек  Нұрлыбекұлы 
- 
ветеринария  ғылымдарының  кандидаты,  «Ветери
-
нариялық  санитариялық»  кафедрасының  аға  оқытушысы,  А.Байтурсынов  атындағы  Қостанай 
мемлекеттік  университеті,  тел.  8
-7141-53-78-
76,е
-mail:  Asylbek555@mail.ru
,  мекен
-
жайы:  110000, 
Қостанай, Маяковский кӛшесі 99/1. 
 
Тагаев  Орынбай  Оразбекұлы 
- 
ветеринарлық  ғылымдарының  докторы,  ветеринариялық  са
-
нитария кафедрасының доценті, А. Байтұрсынов атындағы Қостанай мемлекеттік университеті, 
тел 8
-7142-51-11-73, e-mail: orynbay_tagayev@mail.ru, 
мекен
-
жайы: 110000, Қостанай, Байтурсынов 
47.  
Замуриева  Анна  Валерьевна 
- 
«Ветеринариялық  санитариялық»  кафедрасының  магистрі 
А.Байтурсынов  атындағы  Қостанай  мемлекеттік  университеті,  тел.  87772960802,  e
-mail 
anna_zamurieva@mail.ru. мекен
-
жайы: 110000, Қостанай, Садовая кӛшесі 100а 5 пәтер. 
 
  
 
 
УДК: 616
-097.3; 577.175.642(045) 
 
ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЭСТРАДИОЛУ
 
 
Бермухаметов  Ж.Ж. 
- 
м.т.н.,  Костанайский  государственный  университет  им
. 
А.Байтур
-
сынова
 
 
В статье приведены результаты получения поликлональных антител специфичных эстра
-
диолу  17  β.  Разработаны  эффективные  производственные  схемы  иммунизации  кроликов  для 
получения  специфических  гипериммунных  сывороток  против  эстрадиола  17  β,  обеспечивающие  
высокий специфический иммунный ответ у 100 % подопытных животных. Была проведена работа 
по  оптимизаций  сроков  иммунизации  что  привело  к  еѐ  значительному  сокращению.  Провели 
выделение  имуноглобуллинов  методом
 
сульфат
-
аммонийного  высаливания  с  последующим  их 
обессаливанием на колонке Р
D-10 (Supelco
) содержащей сефадекс 
G-25. 
Тестирование полученных 
сывороток  на наличие специфических антител проводили  в непрямом варианте твердофазного 
иммуноферментного анализа
. 
В результате определено, что
 
препараты специфических антител 
позволяют  проводить  детекцию  чистых  препаратов  эстрадиола,  максимальный  титр 
специфических антител при этом составил 1:6400. 
 
 
Ключевые слова: иммунизация, иммунная сыворотка,антиген,антитело, иммуноген,
 
гаптен, 
конъюгат, эстрадиол.
 
     
ЭСТРАДИОЛҒА ПОЛИКЛОНАЛДЫ АНТИДЕНЕЛЕРДІ АЛУ
 
 
Бермухаметов  Ж.Ж., 
- 
т.ғ.м.,  А.Байтұрсынов  атындағы  Қостанай  мемлекеттік  универ
-
ситеті
 
 
Аталған мақалада, 17 β
 
эстрадиолына тән поликлоналды антиденелерді алу жұмыстарының 
нәтижесі  келтірілген.  17  β
 
эстрадиолына  қарсы  гипериммунды  қан  сарысуын  алу  барысында 
қояндарды  тиімді  ӛндірістік  иммундау  жүйесі  әзірленді,  жұмыс  нәтижесі  бойынша  қолданылған 
зертханалық  жануарлардың  ағзасында  100%  ӛзіне  тән  жоғары  иммунды  жауапты  тудырып  қана 
қоймай, иммунизациялау мерзімін айтарлықтай қысқыртып, еңбек және материалды шығындарды 
тӛмендетті.  Жүргізілген  қондырғылық  сараптама  нәтижесі  бойынша,  ӛзіне  тән  антиденелі 
препараттар,  таза  эстрадиолды  препараттарды  500
-
ден  0,75  мкг/мл  дейін  детекция  жасай 

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
 
8 
алатындығына кӛз жеткізілді, мұнда  ӛзіне тән антиденелердің максимальді титрі  1:6400 құрады. 
Иммунизация  мерзімін оңтайландыру барысында  жұмыстар  жүргізіліп, нәтижесінде уақыт айтар
-
лықтай  қысқарды.  Сульфат
-
аммонилі  тұздандыру  әдісімен  сефадекс  G
-
25  құрайтын  РD
-10 
(Supelco) калонкасында, иммуноглобулинді әдіспен ажыратып алды. Алынған қансарысуындағы ӛзі
-
не  тән  антиденелерді  бар  жоқтығына  анықтау  тікелей  емес  үлгідегі  қатты  фазалы  иммуно
-
ферментті сараптама арқылы жүргізілді. 
 
Негізгі сӛздер: иммунизация, иммунды қан сарысуы, антиген, антидене,
 
иммуноген,
 
гаптен, 
конъюгат, эстрадиол.
 
     
 
RECEIVING POLYCLONAL ANTIBODIES TO ESTRADIOL 
 
Bermukhametov Zhanaidar - Kostanay state university named after A. Baytursinov, Master of Science 
 
The  results  o
f  the  production  of  polyclonal  antibodies  specific  estradiol  17  β.  Efficient  production 
schemes  immunize  rabbits  for  semi-
cheniya specific hyperimmune sera against estradiol 17 β, providing a 
high specific  immune response  in  100% of the test animals. Work  has been done to optimize the timing  of 
immunization which has led to its significant reduction. We conducted selection imunoglobullin by ammonium 
sulfate salting out with subsequent desalting column PD-10 (Supelco) containing Sephadex G-25. Test sera 
obtained  on  the  presence  of  specific  antibodies  was  carried  out  in  indirect  form  of  solid  phase 
immunoassays-element-analysis.  As  a  result,  it  is  determined  that  the  preparations  of  specific  antibodies 
allow  detection  pure  preparations  of  estradiol,  the  maximum  titer  of  specific  antibodies  when  this  was  1: 
6400. 
Keywords:  immunization,  immune  serum,  antigen,  antibody,  an  immunogen,  hapten,  conjugate, 
estradiol. 
 
Введение
 
В современном мире гормональные стиму
-
ляторы роста применяют не только для терапев
-
тических  целей,  но  также  при  выращивании  жи
-
вотных  и  птиц  с  целью  стимуляции  их  роста  и 
развития.  Широкое  распространение  получили 
стероидные
-
половые гормоны: эстрадиол, тесто
-
стерон,  прогестерон  и  их  синтетические  произ
-
водные,  аналоги, обладающие выраженной  ана
-
болической активностью [1]. Однако наряду с их 
выраженной  способностью  увеличивать  привес 
мышечной 
массы, 
стимуляторы 
роста 
кумулируют    в  продовольственном  сырье  и  пи
-
щевых  продуктах.  Синтетические  гормоны,  в  от
-
личие  от  природных  аналогов  более  устойчивы, 
плохо метаболизируются и скапливаются в орга
-
низме  животных  в  значительных  количествах, 
мигрируя  по пищевой цепи в продукты питания. 
Они  способны  сохранять  свои  свойства  в  мясе, 
молоке  животных,  яйцах  птиц,  других  продуктах 
и оказывать токсическое аллергическое и канце
-
рогенное  действие  на  организм  человека.  [2]. 
Снизить  риск  загрязнения  продовольственного 
сырья  гормональными  стимуляторами  можно 
только  при  эффективной  системе  контроля  на 
всех  стадиях  –
 
от  производства  до  реализации. 
Вследствие этого к методам массового контроля 
вредных соединений в сырье и продуктах живот
-
ного  происхождения  предъявляются  жесткие 
требования 
- 
они должны обеспечивать высокую 
чувствительность,  селективность  определения, 
достоверность и воспроизводимость получаемых 
результатов.  Этим  свойствам  соответствует  им
-
муноферментный анализ (ИФА), который широко 
используются  современной  мировой  практике 
для детекции эстрадиола в продуктах. Одним из 
основных  реагентов  при  постановке  ИФА  в  сос
-
таве этих тестов являются специфические  анти
-
тела. При этом получение специфических имму
-
ноглобулинов  к  эстрадиолу  остается  трудновы
-
полнимой задачей, поскольку при использовании 
его  в  качестве  антигена  в  чистом  виде  он  не 
вызывают иммунного ответа [3].
 
Целью настоящей работы было получение 
поликлональных  антител  к  гаптену  эстрадиол 
17β,  пригодных  для  использования  в  ИФА  для 
обнаружения  эстрадиола  17β  в  сырье  и  продук
-
тах животного происхождения. 
 
Материалы и методика исследований.
 
В процессе работы были использованы: β
-
Estradiol  6-(O-carboxyethyl)oxime:BSA  (Sigma), 
Estradiol-BSA  (Cusabio),  Estradiol-OVA  (Cusabio), 
Bovine  Serum  Albumin  «BSA»  (Sigma),  Albumin 
from  chicken  egg  white  «OVA»  (Sigma),  Anti
-17
β
-
Estradiol antibody produced in rabbit (Sigma).  
Иммунизация  животных.
 
Кроликов  имму
-
низировали  препаратами    β
-Estradiol  6-(O-carbo-
xyethyl)  oxime: BSA  (Sigma),  Estradiol-BSA  (Cusa-
bio) в концентрации 0,1  мг/мл  в  фосфатно
-
соле
-
вом  растворе  (ФСР,  рН  7,2)  с  адъювантом  Фре
-
йнда  в  соотношении  1:1.    До  начала  иммуни
-
зации  проводили  отбор  проб  крови  (по  2  мл),  с 
последующим анализом преиммунной сыворотки 
на  кросс
-
реакцию  с  препаратом  конъюгата. 
Антиген  вводили  подкожно,  в  несколько  точек, 
четырехкратно с интервалом  7 суток. 
 
Тестирование  полученных  сывороток.
 
Тестирование полученных сывороток
 
на наличие
 
специфических  антител  проводили    в  непрямом 
варианте  твердофазного  иммуноферментного 
анализа (ИФА). Для проведения ИФА ячейки 96
-
луночного 
полистиролового 
планшета 
для 

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
 
9 
иммунологических  реакций  сенсибилизировали 
гетерологичным  конъюгатом 
Estradiol-OVA  (Cu-
sabio) 
на  ФСР,  рН  7,2  в  концентрации  1мкг/мл, 
при  4°С  в  течение  ночи.  После  инкубаций  план
-
шеты отмывали ФСР с 0,05% твином
-
20. В лунки 
планшета  вносили  сыворотку  крови  кроликов  в 
разведениях и инкубировали при 37°С в течение 
1  часа.  Затем  планшет  отмывали  описанным 
выше  способом  и  вносили  антивидовые  анти
-
тела, меченные пероксидазой хрена (коньюгат) в 
рабочем разведении. После инкубации (1ч, 37°С) 
повторяли  процедуру  отмывки  для  удаления 
несвязанных продуктов реакций и в лунки вноси
-
ли
 
по  0,1мл  субстрата  фермента:  тетраметил
-
бензидин  (ТМБ).  Планшет  инкубировали  10
-15 
минут  пи  комнатной  температуре.  Останавлива
-
ли  реакцию  добавлением  0,05мл  стоп  реагента 
(0,5М р
-
р серной кислоты). Положительная реак
-
ция  характеризуется  окрашиванием  раствора 
субстрата в лимонно
-
желто цвет.  В качестве от
-
рицательного  контроля  использовали  сыворотку 
крови  кроликов  перед  имунизацией.  В  качестве 
положительного контроля использовали коммер
-
ческую  сыворотку  крови  кроликов 
Anti-17
β
-
Estradiol  antibody  produced  in  rabbit  (Sigma). 
Результаты ИФА учитывали с помощью спектро
-
фотометра  с  вертикальным  потоком  света  при 
длине волны 450 нм. 
 
Выделение  и  очистка  иммуноглобулинов
. 
Выделение  имуноглобуллинов  проводили  мето
-
дом  сульфат
-
аммонийного  высаливания  [4,5]. 
Для  этого  к  сыворотке  прибавляли  равный 
объем полунасыщенного раствора сульфата ам
-
мония  и  инкубировали,  мягко  перемешивая  16 
часов при температуре 4°С. Обессоливание про
-
водили  на  колонке  Р
D-10  (Supelco
)  содержащей 
сефадекс 
G-
25  согласно  наставления  к  приме
-
нению. 
 
Результаты исследований.
 
В  результате  проведенной  работы  было 
получено  препаративное  количество  иммунной 
сыворотки.
 
Для  получения  поликлональных  антител 
проводили  иммунизацию
 
лабораторных  живот
-
ных  (кроликов)  коммерческими  коньюгатами. 
Кролики  иммунизировались  по  схеме  приведен
-
ной ниже (таблица 1) 
 
 
Таблица 1 –
 
Схема иммунизации кроликов
 
 
Сутки
 
Доза антигена (мкл на голову)
 
Способ введения
 
1 
500 мкл ПАФ + 500 мкл конъюгата
 
подкожно в 5
-
6 точек вдоль позвоночника
 
7 
500 мкл НАФ + 500 мкл конъюгата
 
подкожно в 5
-
6 точек вдоль позвоночника
 
14 
500мкл ФСБ + 500мкл
 
конъюгата
 
подкожно в 5
-
6 точек вдоль позвоночника
 
21 
500мкл ФСБ + 500мкл
 
конъюгата
 
подкожно в 5
-
6 точек вдоль позвоночника
 
28 
Отбор крови
 
Отбор крови
 
 
Отобранная  на  28
-
е  сутки  кровь    центри
-
фугировалась  при  3
 
000  об/мин  в  течение  10 
минут
 
 
с целью получения сыворотки крови. Дан
-
ная  сыворотка  тестировалась  на  наличие  в  ней 
антител
 
специфичных к антигенным детерминан
-
там  гаптена
-
эстрадиола  посредством  «непрямо
-
го»  варианта  ИФА.  В  качестве  антигена  для 
сенсибилизации  планшета  использовали    гете
-
рологичный конъюгат «Эстрадиол
-
ОВА» и препа
-
раты чистых носителей (ОВА и БСА). Результаты 
ИФА  учитывались  с  помощью  спекротрофото
-
метра при длине волны 450 нм.
 
Далее для освобождения сыворотки  крови 
кролика  от  балластных  антител,  специфичных  к 
антигенным детерминантам БСА нами было про
-
ведено истощение сыворотки по методу  Кастел
-
лани.  По  завершению  методики  истощенная  сы
-
воротка тестировалась на содержание специфи
-
ческих антибиотикам антител (таблицы 2,3). Для 
сенсибилизации  планшета  также  использова
-
лись гетерологичные конъюгаты и нативные бел
-
ки
-
носители в концентрации 1 мкг/мл.
 
 
 
Таблица  2  –
 
Результаты  тестирования  сыворотки  крови  кроликов  иммунизированных 
конъюгатом «β
-Estradiol 6-(O-carboxy
ethyl)oxime:BSA (Sigma)»
 
до и после адсорбций 
 
 
Номер
 
животного
 
Нативная сыворотка
 
Сыворотка после адсорбции
 
Конъюгат
 
ЭСТ
-
ОВА
 
БСА
 
OВA
 
Конъюгат
 
ЭСТ
-
ОВА
 
БСА
 
OВA
 
1-
й кролик
 
1:12800 
1:3200 
1:800 
1:6400 
1:1600 
1:800 
2-
й кролик 
 
1:12800 
1:3200 
1:800 
1:6400 
1:1600 
1:800 
Контроль
 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
 
 

ВЕТЕРИНАРИЯ
 
 
 
 
10 
Таблица  3  –
 
Результаты  тестирования  сыворотки  крови  кроликов  иммунизированных 
конъюгатом «
Estradiol-BSA (Cusabio)
» до и после адсорбций
 
 
Номер животного
 
Нативная сыворотка
 
Сыворотка после адсорбции
 
Конъюгат
 
ЭСТ
-
ОВА
 
БСА
 
OВA
 
Конъюгат
 
ЭСТ
-
ОВА
 
БСА
 
OВA
 
1-
й кролик
 
1:12800 
1:3200 
1:800 
1:6400 
1:1600 
1:800 
2-
й кролик 
 
1:12800 
1:3200 
1:800 
1:6400 
1:1600 
1:800 
Контроль
 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
 
В  результате  тестирования  установлено, 
что  использованные  для  иммунизации  препа
-
раты
 
позволяют  индуцировать  в  организме  жи
-
вотного  выработку  специфических  антител  к  ан
-
тигенным  детерминантам  эстрадиола.  Оба  пре
-
парата, использованных в качестве антигена для 
иммунизации  кроликов,  показали  хороший  ре
-
зультат.  Максимальный  титр  специфических 
антител при этом составил 1:6400. 
 
Заключение
 
Таким  образом,  в  результате  исследо
-
ваний  определены  оптимальные  параметры  им
-
мунизации  лабораторных  животных  и  детекции 
антител  специфичных  эстрадиолу.  Установлена 
способность антигена вызывать иммунный
 
ответ 
(выработку  специфических  антител)  к  антиген
-
ным  детерминантам  эстрадиола  в  организме 
подопытных животных.
 
 
Литература
 
1. 
Бутенко  Р.Г.  и  др.  Клеточная  инженерия 
серия. Биотехнология №3/ М.: «Высшая школа», 
2001. 
2. 
Ковалев  И.Е.,  Полевая  О.Ю.  Биохими
-
ческие
 
основы иммунитета к низкомолекулярным 
соединениям. М 1985.
 
3. 
Егоров  А.М.,  Осипов  А.П.,  Дзантиев  Б.Б., 
Гаврилова  Е.М.  Теория  и  практика  иммунофер
-
ментного анализа. М. 1991.
 
4. 
Д.  Кэтти  Антитела.  Методы.  М.,  Мир, 
1991. 
5. 
А. Ройт, Дж. Брюсстофф, Д. Мейл. Имму
-
нология
- 
М.: Мир, 2000 
- ISBN 5-03-003362-
9 Им
-
мунология в 3 томах / Под. ред. У
. 
Пола
.- 
М
.:
Мир
, 
1988. 

жүктеу/скачать 6,69 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: