Жаныбекович Оптимизация условий трансформации картофеля Магистерский проект на соискание степени магистра технических наук по
Таблица 8 - Основные технологические характеристики безвирусного картофеля
жүктеу/скачать 7,32 Mb.
|
Таблица 8 - Основные технологические характеристики безвирусного картофеля
Как видно из представленных данных (таблица8) по основной физической характеристике –масса клубней высокие показатели у сортов «Аксор, «Тохтар» и линии №Л-1. С этим показателем коррелируют данные по биохимическим характеристикам содержание сухих веществ и крахмала. Большое значение имеет уровень редуцирующих сахаров, которые определяют цвет готовой продукции. Этот показатель может изменяться в зависимости от сроков и условий хранения. По этим данным наилучшие показатели (0,13-0,15%) у сортов «Невский», «Орбита». Незначительное увеличение содержания сахаров показывают сорта «Пикассо» и «Тохтар» и линия №Л-1. Уровень содержания моносахаров определяется ферментативной активностью амилаз, но не коррелирует с содержанием крахмала.В целях более детальной характеристики безвирусного картофеля был проведен анализ содержания белков и аскорбиновой кислоты в клубнях товарного коммерческого картофеля. Предварительные данные свидетельствуют о более низком содержании белка и аскорбиновой кислоты в инфицированных клубнях. 3.5Использование метода «биолистик» в трансформации картофеля Наиболее активно применяемым методом прямого переноса генов является способ генетической трансформации растений с использованием установки «short gun» (дробовик), называемый био(бал)листической трансформацией. Он нашёл самое широкое применение именно для трансформации злаковых. Суть метода заключается в том, что на микрочастицы-носители из химически инертного металла (золото, вольфрам, платина или лёд), размером 0,6-1,2 мкм, осаждается ДНК, а затем они с помощью порохового заряда, сжатого гелия или электрического поля разгоняются до высоких скоростей (1000 м/сек) и поток частиц кратковременно направляют на поверхность клеток. Некоторые из них проникают внутрь клеток и попадают в ядро, где могут включиться в хромосомы растения. Что касается применения баллистического метода для трансформации картофеля, то с его помощью можно переносить гены в клетки суспензионных культур, в первичный и пассируемый эмбриогенный каллус, в организованные ткани: примордии, незрелые зародыши, меристематические ткани. Первое время для получения трансгенных растений в качестве мишени при баллистической трансфекции широко использовали эмбриогенную суспензионную культуру клеток. Низкая степень агрегированности суспензии обеспечивала вероятность попадания микрочастиц с ДНК во все клетки мишени. Тем не менее, частота трансформации была очень низка, например, для получения 1 трансгенного растения бомбардировали 7-10 чашек эмбриогенной суспензионной культуры картофеля. Эффективность трансформации для разных объектов картофеля в экспериментах составляет от 1% до 3% (после оптимизации метода), в отдельных случаях достигает 10%, но при этом не все растения экспрессировали полную конструкцию вводимых генов. Следует отметить, что число копий вводимого гена на растительный геном при бомбардировке достаточно неопределённо, причём многие из этих копий представлены в виде неполных последовательностей, что может приводить к нежелательным последствиям, в том числе и к «молчанию» генов. В наших экспериментах молекулярный анализ трансгенных растений картофеля, полученных методом баллистической трансфекции, показал, что число интегрированных фрагментов ДНК варьирует от 1 до 20 копий. Наиболее удачные растения получены с 1-4 копиями и с 3-8 копиями. Для процедуры генетической трансформации методом бомбардмента нами использовались генно-инженерные конструкции на основе плазмиды pCAMBIA2300, в которуюпод управлением промотора и терминатора вируса цветной капусты (CaMV) был вставлен ген EcCspA(рисунок 13). Рисунок 13 – Карта плазмиды pCAMBIA2300, несущей трансгенную вставку Основной белок холодового шока E.coli CSPA состоит из 70 аминокислотных остатков; белок состоит из пяти анти-параллельных β-слоёв и имеет два РНК-связывающих мотива RNP1 (Phe18-Gly19-Phe20) и RNP2 (Phe31-Val32-His33) [25-27]. Известно, что белок CSPA является антитерминатором транскрипции [28] и неспецифично связывает одноцепочечные РНК и ДНК [25]. Рисунок 14 – Трансформация клеток картофеля Ещё одним недостатком баллистического метода является ограничение размера вводимых генетических конструкций. Как правило, удаётся перенести ДНК размером не более 10 тысяч пар оснований. Плазмиды большего размера плохо закрепляются на металлических частицах или разрушаются при «бомбардировке». Несмотря на недостатки, метод баллистической трансформации в настоящее время считается наиболее эффективным для растений среди методов прямого переноса генов. Рисунок 15- работа с«генной пушкой» В данной работе мы сделали попытку введения генахолодоустойчивостиEcCspA, а также 5.,НТП М-вируса картофеляметодом биобаллистики (рисунок 14). Исследования продолжаются. По данным результатов исследований будут даны рекомендации по трансформации и микроклональному размножению безвирусных растений картофеля. жүктеу/скачать 7,32 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|