Жаныбекович Оптимизация условий трансформации картофеля Магистерский проект на соискание степени магистра технических наук по
Пролиферация побегов и микрочеренкование стерильных проростков
жүктеу/скачать 7,32 Mb.
|
Каримов Нурлыбек антиплагиат
- Бұл бет үшін навигация:
- 2.6Иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления вирусной инфекции растений картофеля
- 2.7. Электрофоретическое разделение белков для идентификации генотипов картофеля
| Пролиферация побегов и микрочеренкование стерильных проростков.
Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги. Растения, сформировавшие 5–6 листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов [19]. Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы: при температуре 24–25оС днем и 19–20оС ночью, освещенности 5–6 кLx и продолжительности фотопериода 16 часов. Рост стебля и корней начинается на 3–4 день после посадки на питательную среду, а полностью растения формируются через 12–15 дней.Каждое последующее черенкование проводят через 14–20 дней. Из одного растения можно получить 5–8 черенков, а через 2–3 месяца – 3–5 тыс. черенков. Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам). Индукция корнеобразования при микроклональном размножении растений.Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их необходимо пересадить на новую питательную среду. Черенки и побеги легко укореняются на средах с обедненным составом минеральных солей (МС, разбавленная вдвое), либо на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК. При тестировании полевых растений на наличие вирусной инфекции для ИФА пробы листьев растений отбирали по диагонали площади посадки. При этом из первой полевой репродукций 50 растений из расчета на га. 2.6Иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления вирусной инфекции растений картофеля Листья сортообразцов перед фазой цветения отбираются для иммуноферментного анализа на наличие вирусной инфекции. С каждого сортообразца отбираются листья с каждого яруса от 10 растений. Иммуноферментный анализ основан на мечении антител ферментами, которые образуют с антителами достаточно прочные комплексы-конъюгаты, а также на адсорбирующей способности белковых частиц иммунноглобулинов (антител) на поверхности органических полимеров [16]. Принцип метода: В лунки полистирольных планшетов вносятся специфические антитела, которые в течении определенного времени адсорбируются на поверхности лунок. Далее в эти лунки вносится сок тестируемых растений. Если в тестируемом соке содержиться вирус, он связываеться с фиксированными на поверхности лунок антителами (первая иммунная реакция). Затем на полученный фиксированный комплекс антиген-антитело наносятся антитела, меченные ферментом, которые наслаиваются на детерминанты молекул антигена (вторая иммунная реакция). После добавления в лунки соответствующего ферментного субстрата, в случае наличия вируса в тестируемом соке растения происходит цветная ферментная реакция. Результаты анализа оценивали визуально и на специальном приборе – иммуноферментном анализаторе. Для проведения ферментативной реакции проводятся следующие действия: наливают по 0,1 мл свежеприготовленного субстрата в лунки и инкубируют до развития окраски при комнатной температуре в течении 20-40 минут. После чего реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,05 мл 3М Н2SO4. При наличии вирусного заражения образуется комплекс вирус-антитело. Обязательно готовят контрольные плата (без заражения).Результаты анализа оценивают в начале визуально. В результате реакции между ферментом и субстратом окраски растворов в лунках плата изменяются в зависимости от степени заражения вирусом: нет окраски – «-» – вирус отсутствует, светло-коричневая окраска – «+» – среднее заражение вирусом, ярко-коричневая окраска –«++» – высокая степень заражения вирусом. Более точная оценка проводится на иммуноферментном анализаторе (ИФА) (рисунок 12). Растения, показавшие наличие даже незначительной концентрации вирусов выбраковываются. Фенологические наблюдения за ростом и развитием оздоровленных растений картофеля и все учеты проводились в соответствии с методикой, разработанной в исследовательском центре картофельного и овощного хозяйства. 2.7. Электрофоретическое разделение белков для идентификации генотипов картофеляЭлектрофорез белков. Суммарный электрофорез белков пробирочных растений проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецильсульфата натрия (ДДС-Na) [17].Навеску свежего растительного материала массой 1 г растирали в фарфоровой ступке на холоду при t = 2-4°С с небольшим количеством промытого кварцевого песка, добавляя туда постепенно трис-буфер для равномерного растирания, первоначально 3-4 мл, а затем добавляя по 1 мл. Гомогенную массу переносили в центрифужную пробирку, и гомогенат центрифугировали при 15 тыс. оборотов в мин. в течение 15 мин. 1. Раствор акриламид/бис-аккриламидного раствора (30,8%Т 2,7%С): 2. 4Х буфер для разделяющего геля (1,5 М Tris-HCl, pH 8.8): 3. 4Х буфер для концентрирующего геля (0,5 М Tris-HCl, pH 6.8): 4. 10% SDS (додецилсульфа натрия, ДСН): 5. 10% раствор PSA (персульфата аммония): 6. 2Х буфер для образцов (0,125 М Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% v/v глицерин, 0,2 М ДТТ, 0,02% бромфеноловый синий, pH 6.8): 7. Электродный буфер (0.025М Tris-HCl, 0.192М Глицин, 0.1% ДСН, pH- 8.3 Таблица 2- Состав растворов для электрофореза
жүктеу/скачать 7,32 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|