Жаныбекович Оптимизация условий трансформации картофеля Магистерский проект на соискание степени магистра технических наук по
Диагностика вирусной инфекции картофеля
жүктеу/скачать 7,32 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- 3.3. Биохимическая идентификация генотипов картофеля
| 3.2. Диагностика вирусной инфекции картофеля
Для тестирования пробирочных растений на наличие вирусной инфекции методом ИФА с каждого генотипа картофеля отбирались по 3 образца (у каждого растения брали нижний черенок с листочком). Были использованы тест-системы на вирусы PVY, PVX, PVM, PVS, PLRV. Как видно из таблицы 4, при проведении первого тестирования на вирусы PVX, PVY, PVS, PVM, PLRV в линиях Л-1 ис. Санте показали зараженность вирусами PVM, PVM, с. Аксор, с. Пикассо PLRV. Все инфицированные линии были выбракованы, а остальные линии размножали дальше, ведя постоянный контроль на вирусную инфекцию. Размножение пробирочных растенийкартофеля осуществляли черенкованием с интервалом в 20-25 дней на среде МС с добавлением ИУК и БАП. Отмечено, что сочетание этих регуляторов роста способствует образованию междоузлий. Надо отметить, что это является важным моментом при черенковании. Чем больше междоузлий, тем больше микрочеренков. Растения черенковали, когда растение в пробирке достигало высоты 6—8 см и имело не менее 4—5 междоузлий. В стерильных условиях растения разрезали на части по числу междоузлий и каждый черенок высаживали в пробирку с питательной средой для дальнейшего размножения. Культивирование растений проводили при температуре воздуха 24-26ОС, освещенности 3 тысячи люкс на стеллажах с лампами дневного света в светокультуральной комнате. Таблица 4 – Тестирование картофеля на наличие вирусной инфекции
Тестирование сортообразцов картофеля на наличие вирусной инфекциис использованием набора тестеров к вирусам(ИФА, оптическая плотность на приборе Multiskanplus, фильтр 450) Нами введены в культуру invitro6перспективных сортов и 3 линии картофеля казахстанской и голландской селекции, годных для возделывания в Карагандинской, Акмолинской. Алматинской областях. Получено и размножено методом микроклонирования 5 тысяч пробирочных безвирусных растений картофеля. 3.3. Биохимическая идентификация генотипов картофеля Растения-регенеранты, индуцированные в культуре апикальной меристемы invitro, свободные от вирусной, микоплазменной, грибной инфекции, представляют уникальный объект для биохимических исследований. В процессе оздоровления сортов картофеля при использовании методов апикальных меристем, при индуцировании роста пробирочных растений из каллусных тканей может произойти изменение генотипа растений, что приведет к появлению сомаклональных вариантов сортов. В связи с этим, при проведении работ по получению и микроклональному размножению безвирусного семенного материала картофеля важно установить генетическую идентичность пробирочных растений, микроклубней, тепличных клубней и полевых клубней изучаемых сортов. Электрофоретическое разделение белков картофеля представляет интерес с точки зрения выявления различий, возникающих в составе белков микроклубней, тепличных и полевых клубней одного сорта, а также с точки зрения оценки генетической близости сортов. Особенно это важно при изучении безвирусного, здорового материала, что позволит получить более объективные данные о генотипах изучаемых форм. Для выделения белка использовали листья пробирочных безвирусных растений, а также тепличныхрастений картофеля.При электрофорезе на стартовые участки геля наносили одинаковое количество белка. Полученные спектры белков картофеля содержали компоненты в диапазоне от 11,7 до 200 кД (рисунок-5). Интенсивность этих белковых зон неодинакова в образцах, полученных при различных условиях развития растений. Они более интенсивны при развитии в почвенном грунте по сравнению с пробирочными растениями. фосфорилаза B – 97,0 кДа, бычий сывороточный альбумин (БСА) – 66,2 кДа, овальбумин – 45,0 кДа, карбоангидраза – 31,0 кДа, ингибитор трипсина – 21,5 кДа, лизоцим – 14,2 кДа. Рисунок 5 - Электрофореграмма белков (маркеры белков слева) На электрофореграмме отчетливо были видны белковые компоненты с молекулярной массой 12кД, 21кД, 25 кД, 28 кД, 36 кД, 41 кД 52кД. Для всех этапов развития растений invitro характерен стабильный синтез двух белковых компонентов, относящихся к 53 кД и 13 кД. Белок с молекулярной массой 53 кД, является ферментом фотосинтеза – рибулозо-1,5-дисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско), а белок с молекулярной массой 11,7 кД – это белок цитохром с. При изучении спектров белков растений картофеля выявлены фракции с молекулярной массой 32-35 кД. Из анализа данных литературы известно, что мол.м. капсидных белков составляет – от 30.0 – 33.0 кД. Выявление этих белковых компонентов при электрофорезе в условиях денатурации, возможно, обусловлены температурными условиями, выше нормы. Общее содержание белков в растениях в условиях фитогормонального воздействия при развитии в почвенном грунте и в пробирочных условиях практически одинаково. Таким образом, белки на ПААГ у растений-регенерантов картофеля распределялись в диапазоне от 11 до 200 кД. Спектры белков листьев картофеля в качественном отношении стабильны, хотя могут быть некоторые количественные различия (по интенсивности окраски полос в спектрах). Интенсивность этих белковых зон неодинакова в разных условиях развития растений. Они более интенсивны при развитии растений в почвенном грунте, чем у пробирочных растений. Нами выявлена относительная стабильность спектров оздоровленных пробирочных и тепличных растений картофеля. Выделение вирусов из зараженных растений картофеля. Для препаративного выделения вирусов использовали зараженные листья картофеля, отобранные в полевых условиях. Вирусы выделяли из небольших навесок зараженных листьев по общепринятой методике (Hull, 2002) с модификациями, которые касались применение 5% Тритона Х-100 (вместо органических растворителей) при экстракции нитевидных вирусов и их концентрирование путем ультрацентрифугирования на сахарозной подушке (вместо осаждения полиэтиленгликолем). Методами электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблота с использованием антисывороток к очищенному препарату вируса YBK и к белку оболочки установлено, что основной белок оболочки вируса YBKимеет мол.м. 40 кДа (рисунок 8.). Белки были окрашены в геле Кумасси (1, 2) или перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и окрашены антисывороткой к белку оболочки YBK (3) или нормальной кроличьей сывороткой (4). Слева –мол. масса белков-маркеров Рисунок 8. Электрофорез и иммуноблот препарата YBK Анализ препарата РНК, выделенной из вирусных частиц, показал, что она практическине связывается с олиго-dT-целлюлозой и, следовательно, не содержит поли(А)-последовательности.Кроме того, в полиакриламидных гелях выявлялись 2 минорные зоны с мол.м. 80 и 120 кДа. Антисыворотки к интактному вирусу и к основному белку оболочки YBKокрашивали все три белковых зоны. Таким образом, белковые зоны с мол.м. 80 и 120 кДа являются, по всей вероятности, олигомерами белка оболочки, частично ковалентно связанными в составе вирусной частицы. При исследованиикоротких вирусных РНК молекул в растениях инфецированных вирусами нами выявлена аккумуляция коротких вирусных РНК в листьях растений. Также была обнаружена корреляция наличия вирусной инфекции с синтезом белков растений ассоциированных с устойчивостью растений. Инокуляция пробирочных растений картофеля РНК содержащими вируса и оценка системного размножения вируса.Полученные РНК-транскрипты были инокулированы методом rub-инокуляции растений картофеля с добавлением вспомогательного агента карборандрума. Он заключается в механической инокуляции сеянцев в стадии 2-х настоящих листьев с помощью опрыскивания под давлением 6 атмосфер инфекционным соком с вирусом ХВК, SBK, YBK, MBK и ВСЛК в смеси с карборундом, что эффективно для выделения иммунных растений. Через 2-3 недели после заражения растения с симптомами выбраковывали, а оставшиеся высаживали в грунт. Степень устойчивости определяли по времени появления некрозов на листьях расположенных выше места заражения. Ранние симптомы (через 15 дней) указывают на отсутствие устойчивости, поздние (через 35 дней) - на устойчивость образцов. Промежуточные сроки (20-25 дней) – показывают разную степень устойчивости. Эта оценка не является окончательной, требуется дальнейшее полевое испытание в условиях инфекционного фона в течение 2-3-х лет. Распространение системной инфекции вируса и его аккумуляция в тканях растений визуализировали под ультрафиолетом.При анализе оценки системного заражения вируса выявлено системное накопление вируса в листьях растений картофеля методом визуализации флуоресцентного GFP белка в листьях. Показано, что при системной аккумуляции вируса происходит выключение GFP вставки из состава вирусной РНК. Что свидетельствует о высокой рекомбинации вирусных РНК молекул. Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами. Возделывание устойчивых к вирусам растений существенно снижает потери отвирусных заболеваний. Один из подходов к созданию устойчивости основан на стимуляциизащитных механизмов растения с помощью элиситоров. Биогенные элиситорыолигосахаридной природы (β-1,3-глюканы, фрагменты хитина и хитозана, галактурониды,ксилоглюканы) – важнейшие сигнальные молекулы у растений. Возникая in vivo придеструкции клеточных стенок, они индуцируют экспрессию защитных генов и запускаюткаскад местных и системных реакций, препятствующих дальнейшему размножениюфитопатогена. Одним из самых известных элиситоров является хитозан (β-1,4-поли-D-глюкозамин),который обычно получают деацетилированием хитина ракообразных в щелочных условиях. Для индукции устойчивости к вирусам нами были предприняты попытки по изучение механизма противовирусной активности хитозана.Обнаружено, что при обработке хитозаном нижней поверхности листа картофеля устойчивость к заражению YBK, развивалась и на его верхней поверхности, при обработке одной половины листа устойчивость развивалась и в другой, необработанной хитозаном половине, при обработке нижних листьев устойчивость наблюдали также и в верхних. Эти результаты показывают, что хитозан индуцирует в растениях системную устойчивость. Известно, что в растениях с индуцированной системной устойчивостью мишенью для защитных реакций может являться любая стадия инфекционного процесса (Gilliland et al., 2006; Palukaitis & Carr, 2008). В эксперименте использовали высокомолекулярный хитозан с мол.массой 120 кДа и степенью ацетилирования 30%, полученный из панциря криля (Sea Fishering Institute, Гдыня, Польша). Хитозан растворяли в 0,05% уксусной кислоте на магнитной мешалке и доводили рН раствора до 6,0 с помощью 0,1 М КOH. Листья опрыскивали раствором хитозана до или после инокуляции один или несколько раз в зависимости от цели эксперимента. Для заражения растений использовали экстракт из зараженных вирусом YBKрастений картофеля. На половину листа наносили 20 - 30 мкл инокулюма. Электрофоретический анализ лизатов листьев картофеля показал, что хитозан стимулирует продукцию нескольких клеточных белков, в особенности белка с мол.массой около 130 кДа (р130) (рисунок 9). 1 2 3 4 5 6 1, 2, 3 – концентрация хитозана, соответственно, 25, 50 и 100 мкг/мл; 4 – с хитозаном (100 мкг/мл) без инкубации; 5 – без хитозана; 6 – белки-маркеры. Сверху вниз: 94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кДа. Рисунок 9 - Электрофоретический анализ лизатов листьев, зараженных YBK По-видимому р130 может играть роль в ингибировании вирусной инфекции. Принимая во внимание молекулярную массу этого белка и то обстоятельство, что в лизатах листьев обнаружена индукция хитозаном РНК-полимеразной активности, можно предположить, что р130 является клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразой, а противовирусная устойчивость, индуцируемая хитозаном, частично опосредована механизмом РНК-интерференции. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что клеточные белки, синтезируеые элиситерами, могут участвовать в ингибировании вирусной инфекции у растений. жүктеу/скачать 7,32 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||