Жумина Асем Галымовна Тулегенова Сымбат Ержанқызы «Жасушалық биотехнология» пәні бойынша
жүктеу/скачать 4,2 Mb.
|
multi-213 x606468403
- Бұл бет үшін навигация:
- ГАПЛОИДТЫ ЖАСУШАЛАРДЫҢ ӨСІМДІК ӨСІРІНДІСІ
| 2. Суспензиялы өсімдік өсірінділері
Суспензиялы өсірінді – аэрациямен қамтамасыз ететін және араластыратынқұрылғы көмегімен, өлшенген сұйық ортада өсірілетін жеке немесе бірнеше жасуша топтары (сурет 2). Суспензиялы өсірінділер екінші ретті метаболизм жолдарын, ферменттер индукциясы және гендердің экспрессиясын, бөтен байланыстардың кері кетуін, цитологиялық зерттеулерін зерттеуде модельдік жүйе ретінде кеңінен қолданады. Сурет 2. Суспензиялы өсірінділерді өсіру А. Суспензиялы жасуша өсіріндісін өсіруге арналған құты Б. Суспензиялы жасуша өсіріндісі Жақсы бағыттың белгісі болып жасушалардың зат алмасуға қайта құрылуға қабілеттілігі және нақты жағдайда дақылдаудың жоғары жылдамдықпен көбейеді. Мұндай бағыттың морфологиялық сипаттамасы : 1. Агрегатсызданудың жоғары деңгейі (әр топта 5-10 жасушадан). 2. Жасушалардың морфологиялық тегістігі (үлкен емес өлшемдері, шар немесе сопақша формалы, тығыз цитоплазма). 3. Трахеид тәрізді элементтері жоқ. Каллусты ұлпаны сұйық қоректік ортаға салып, жасушалы суспензияны алады. Суспензияны колбада, 100-120 а/мин жылдамдықпен айналдыратын тербелмеде айналдырады. Жаңа ортаға бірінші рет ауыстыруда нейлонды елекпен, сәйкес саңылауы бар шприцпен, 1 – 2 қабат мәрлімен сүзгілеп каллустың ірі бөліктерін және ірі агрегаттарын алып тастайды. Суспензиялы өсіріндінің бастапқы жүктемесі үшін 60 -100 мл сұйық қоректік ортаға каллусты өсіріндінің 2-3 г жаңа массасы қажет. Әрбір жасуша өсіріндісініңбағыты үшін өсірінді өспейтін аз өлшемді, минималды инокулят көлемі болады. Суспензиялы өсіріндінің өсуін бағалайтын көрсеткіштер: 1. Тұнған жасушалардың көлемі (ТЖК). Суспензиялы өсіріндінің кішкене бөлігін көлемі 15 мл болатын конус тәрізді өлшеуіш шыны түтікке ауыстырады. 200 g. жылдамдықпен 5 минуттай центрифугалайды. ТЖК–суспензия көлемінен тұну көлемін көрсететін шама, әдетте % есептеледі. 2. Жасуша саны. Фукс-Розенталь камерасында саналады. 3. Ылғалды немесе құрғақ масса. Жасуша суспензиясы әлсіз вакуумді Бюнхер құйғышына қойылған, өлшенген және дымқылданған сүзгіш арқылы сүзіледі. Жасушаларды дистиллденген суда жуып, вакуумде суды тартып алып, сүзгішпен қайта өлшейді. Құрғақ масса – аналогты түрде анықталады, бірақ құрғақ фильтр өлшенеді де, жасушалар фильтрмен бірге 60 оС термостатта кептіреді. 4. Ақуыз құрамы. Жасуша ақуызын анықтау үшін шыны талшықты сүзгіде жинап, екі рет ыстық 70% этанол ерітіндісімен жуып, ацетонмен кептіріп, бір жарым сағат 85 оС температурасында 1М NaOH гидролиздайды. Кейін сүзгілейді және Лоури бойынша ақуызды анықтайды. 5. Ортаның өткізгіштігі. Кондуктометрдің көмегімен анықтайды. Ол керісінше жасушаның жаңа массасына пропорционал. 6. Жасушалардың тіршілікке қабілеттілігі. Микроскоптың көмегі арқылы цитоплазманың қозғалуымен, сондай-ақ жасушаларды бояғыштармен (флюоресцеиндиацетат, тетразолия тұздары, Эванс көгі) бояу арқылы бағалайды. Тірі жасушалар өткізгіш емес жасуша мембранасының болуына байланысты боялмайды. Жақсы өсетін суспензия S-тәрізді қисық өсетін бірнеше бөліктері бар: 1- латентті, немесе лаг-фаза, ешбір көрсеткіштер бойынша өсу байқалмайды; 2 - экспоненциалды, өсу жылдам жүреді; 3 - сызықты, өсі жылдамдығы бір қалыпты; 4 –жай өсу фазасы; 5 - стационарлы фаза; 6 –жасушаның кері кету фазасы. Нақты қисық өсу модельдік түрден ерекшеленуі мүмкін. Қисық өсудің формаларына популяцияның(өсімдік түрі) генетикалық сипаттамасы, инокулят саны, өсіру жағдайы (орта құрамы, рН бастапқы өлшемі, газды фазаның құрамы, араластыру жылдамдығы) әсер етеді. Дақылдауды екі түрлі жүйеге бөледі: ашық және жабық. Жабық жүйеге өсірудің периодты режимі тән. Жасушалық масса (инокулят) белгілі бір ортаға салынады. Өсіру аяқталғанға дейін газдардан басқа, барлық көрсеткіштер бойынша жүйе жабық болады. Мерзімді түрде жаңа қоректік ортамен ауыстырылып, сол мөлшерде ескі орта алынып тасталады. Барлық өсіру циклінде жасушалар жүйеде болады. Ашық (ағындық) өсірінділер тек жаңа қоректік ортаның келуімен және ескі қоректік ортаның алынып тасталуымен ғана сипатталып қоймайды, сондай-ақ жасушалық массаның кей бөлігі де алынады. Жабық тереңдік дақылдау көптеп зерттеліп, таралған. Аэрациялау және араластыру үшін түрлі аппаратуралар қолданады: роллерлер, тербелмелер, магнитті араластырғыштар және т.б. Жай араластыру мен аэрацияны ферментерге берілетін ауаның, тығыз стерильді ауа көмегімен араластыратын пневматикалық тәсіл қамтамасыз етеді. Бұл тәсілдің кемшілігі бар, себебі дақылдық ортада ауа артылуы туындап, ол оттегінің жеткіліксіздігіне әкеледі. Ортада жасушаның өсуі мен екінші ретті зат алмасуы оттегінің концентрациясынабайланысты. Микробиологиялық жүйелерде биомассаның өсуі, өажетті өнімнің шығуы және оттегімен қамтамасыз етудің арасында өзара байланыс бар екені зерттелді. Өсімдіктер үшін мұндай мәліметтер жоқ. Жасуша өсуіне оттегіден басқа да газдар әсер ете алады. Мысалы, көмірқышқыл газы лаг –фазаның ұзындығына әсер етуі мүмкін. Аэрацияның жоғары деңгейі өсу мен екінші ретті зат алмасудың өнімдерінің синтезіне кері әсерін тигізуі мүмкін. Себебі одан көмірқышқыл газы мен ұшқыш қосылыстар кетеді. in vitro өсімдік жасушаларын микроағзалармен салыстырғанда дақылдау үшін түтіктерді құрылымдағанда есептелуі қажет тыныс алуы қарқындылығы төмен болады. Өсімдік жасушаларының суспензиялы өсірінділерінің ерекшелігі – өсу үшін қажет жоғары тығызды. Сондықтан өсімдік жасушасын дақылдаудағы қиындық – биомассаның өсуін сүйемелдейтін тұтқырлықтың көбеюі. Бұл адгезияға әкеліп соғады. Жасушалардың бір-біріне адгезиясы (жабысуы), өсірінділік түтікшелердің жоғарғы беттерінде және оған салынған араластырғыштар мен түтіктерге қиындық тудырады. Түтікшенің жоғарғы бөлігінде жасушалардан бөлінетін ақуыздар мен полисахаридтерден тұратын көпіршіктер түзілуі мүмкін. Дақылдау процесінде жасушалар жабысып, олардың біраз бөлігі осы көпіршікте жиналып, «қабыршақ» немесе «безе» түзеді. Жасушалар биомассасының көбеюінен «қабыршақта» көбейіп, араластыру қарқындылығын азайтып, соңында өсіріндінің өлуіне әкелуі мүмкін. Өсімдік жасушалары микроағзалармен салыстырғанда физиологиялық және метаболиттік белсенділігі төмен болады. Өсімдік жасушасының бір тұқым беру уақыты (екі тізбекті жасуша бөлінулердің арасындағы интервал) микроб жасушасының тұқым беру уақытынан 60-100 есе асып түседі. Жасуша пролиферациясының ортақтастығы 50—60% аспайды, көптеген жасушалар жылдам бөлінулерін тоқтатып, тыныштық фазасына көшеді. Бұл барлық мән-жайлар жинақтық немесе мерзімдік өсірумен жасуша популяциясының жалғасымды өсуін анықтайды. Зарарсыздықты ұзақ уақыт сақтау үзіліссіз дақылдауда техникалық мәселердің бірі болып табылады. Мерзімді немесе жинақтық дақылдау – әзірге дәстүрлі болып саналатын жасушаларды өсірудің ең оңай тәсілі болып саналады. Суспензиялы өсірінділерді екінші ретті метаболиттерді өндірістік алу үшін қолданады. Өсімдік жасушаларынан өндірілетін заттар медицинада, парфюмерлік өндірісте, өсімдік шаруашылығында және басқа да өндірістің басқа да салаларында қолданады. Оларға алколоидтарды, терпеноидтарды, гликозидтер, полифенолдар, полисахаридтер, эфир майлары, пигменттер, антиканцерогендер (птотецин, харрингтонин), пептидтер (фитовирус ингибиторлары) жатады. Қазіргі кезде көптеген елдерде экономикалық маңызды заттарды алуда биосинтетикалық өндірісте жүздеген өсімдіктер (женьшень, жыланды раувольфия, итжидек, шығыршықты итжидек, жүнді және пурпурлы оймақгүл, дельта тәрізді диоскорея, торғайшөп, кәдімгі меңдуана, меруертгүл, жоңышқа, агава, апиын көкнәр және т.б.) қолданылады. Екінші ретті метаболиттерді алудың өзінің ерекшеліктері бар. Жасушалық биомассаның көбеюіне және екінші ретті метаболиттерді синтездеуге әкелетін жасушалардың бөлінуі уақыттарға бөлектенеді.Екінші ретті метаболиттердің жиналуы жасуша популяциясының баяу өсу фазасында өсіп, стационар фазасында максимумға жетеді. Кейбір алкалоидтар максимальды митоздық белсенділік (экспоненциалдық өсу) фазасында синтезделеді. Мұндай заңдылықтарды білу бағалы заттарды алу процестерін реттейді. Жасушалардың өсу белсенділігін және жасуша пролиферациясын бұғаттайтын механизмдер мен жағдайлар бір мезгілде екінші ретті метаболизм ферменттерін активтендіреді. Жасушаларға әсер ететін экспоненциалды фазаның соңында спецификалық стресстік жағдайлар екінші ретті метаболиттердің синтезіне көшуіне жағдай жасайды. Әдебиеттер: 1. Вечканов Е.М., Сорокина И.А. Основы клеточной инженерии: уч. пос. Ростов-на-Дону, 2012. – 136 с. 2. Тұрашева С.Қ. Клеткалық биотехнология: Оқулық. Алматы: ЖШС РПБК «Дәуір», 2011 – 260 б. 3. Р.Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. Москва, Мир, 1983. 4. Уәлиханова Г.Ж. Өсімдік биотехнологиясы: оқулық. Алматы: ЖШС «Дәуір», 2009 – 336 б. ДӘРІС 11. ГАПЛОИДТЫ ЖАСУШАЛАРДЫҢ ӨСІМДІК ӨСІРІНДІСІ жүктеу/скачать 4,2 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|